零基础入门转录组数据分析—

零基础入门转录组数据分析——DESeq2差异分析

1. 转录组分析基础知识

1.1 什么是转录组？
转录组（transcriptome） 是指在某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，这些产物主要包括信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）以及非编码RNA（ncRNA）。其中，编码RNA可以通过转录和翻译过程产生蛋白质，从而直接调控生命活动；而非编码RNA具有调节基因表达的作用，它们可以对染色体结构、RNA加工修饰及稳定性、转录和翻译、甚至蛋白质的转运及稳定性产生影响。
（简单来说：转录组是指一个活细胞在特定时间和环境下，所能转录出来的所有RNA的总和。因此，转录组分析就是为了了解基因的表达调控机制和功能。）

1.2 差异分析是什么？为什么要做差异分析？
转录组差异分析是一种生物信息学分析方法，旨在比较不同样本或条件下转录组数据的差异，以揭示基因表达的变化。
（简单来说：就是从上w个基因中找出不同样本中表达具有差异的基因，从而了解这些差异基因如何影响生物体的生理功能和疾病发生发展。）

1.3 在R中对于转录组数据都有哪些差异分析的方法？
包括但不局限于DESeq2、limma和edgeR等。
DESeq2： 基于负二项分布模型进行差异分析，考虑了测序深度和基因长度对count数据的影响，因此在处理高度变异的基因时表现较好。DESeq2还提供了多种标准化方法，可以帮助减少批次效应和其他技术噪声。
limma： 最初是为微阵列数据设计的，后来也扩展到RNA-Seq数据分析。它使用线性模型进行差异分析，并且可以轻松处理多个因素和协变量。limma的优势在于其速度和灵活性，可以处理大量的基因和样本。
edgeR： 也是基于负二项分布模型进行差异分析，但与DESeq2不同的是，它使用了经验贝叶斯方法来估计分散参数，从而提高了差异检验的准确性和稳定性。edgeR在处理大型转录组数据集时表现出色，尤其是在识别低表达水平的差异基因方面。

1.4 三种方法对于输入数据的要求？
DESeq2： 需要原始的count矩阵（如通过htseq-count工具获得），并且只支持重复样品。
limma： 可以接受原始的count矩阵，但需要用户自行进行标准化（通常是log转换），并且也支持重复样品。
edgeR： 要求输入原始的count矩阵，既支持单个样品也支持重复样品。

1.5 在做转录组分析的时候该选用哪种方法？（关键）
GEO芯片数据——用limma差异分析，因为GEO芯片数据底层已经对数据做了标准化处理。
（数据参考：零基础入门转录组分析——数据处理（GEO数据库——芯片数据））

GEO高通量数据——用DESeq2差异分析，因为可以获取到count数据。
（数据参考：零基础入门转录组分析——数据处理（GEO数据库——高通量测序数据））

TCGA_count数据——用DESeq2差异分析，因为可以获取到count数据。
（数据参考：零基础入门转录组分析——数据处理（TCGA数据库））

自测序数据——用DESeq2差异分析，因为可以获取到count数据。
（数据参考：零基础入门转录组分析——数据处理（自测序数据））

注：目前了解到的很少用到edgeR，一般来说有重复的样本通常limma和DESeq2就能解决（edgeR这种方法不做过多介绍）。

2. DESeq2差异分析（Rstudio）

本项目以GSE203346数据集(高通量测序数据)展示DESeq2差异分析过程
实验分组：疾病组（18例），对照组（19例）
R版本：4.2.2
R包：tidyverse，lance，DESeq2

注：只要是能获取到count，并且有重复分组，都能用DESeq2做差异分析

数据处理过程参考之前的教程：零基础入门转录组分析——数据处理（GEO数据库——高通量测序数据）

设置工作空间：

rm(list = ls()) # 删除工作空间中所有的对象
setwd('/XX/XX/XX') # 设置工作路径
if(!dir.exists('./01_DEGs')){
  dir.create('./01_DEGs')
} # 判断该工作路径下是否存在名为01_DEGs的文件夹，如果不存在则创建，如果存在则pass
setwd('./01_DEGs/') # 设置路径到刚才新建的01_DEGs下

加载包：

library(tidyverse)
library(lance)
library(DESeq2)

导入处理好的表达矩阵：

dat <- read.csv('../../00_rawdata/GSE203346/dat.GSE203346_count.csv', check.names = F, row.names = 1)%>%lc.tableToNum()

dat如下图所示行名为基因symbol，列名为样本ID，表中数字是原始count（都是整数，并且不需要做任何处理）
在这里插入图片描述
导入处理好的分组信息表：

# 分组信息
colData <- read.csv('../../00_rawdata/GSE203346/group.GSE203346.csv')
colData$group <- factor(colData$group, levels = c("control","disease"))
table(colData$group)
dat <- dat[, colData$sample] # 让表达矩阵的样本与分析信息表保持一致

colData如下图所示，第一列为样本ID，第二列为样本分组
在这里插入图片描述
先创建DESeqDataSet对象（这里会用到前面导入的 dat和colData ）

dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = dat, colData = colData, design = ~group)

dds如下图所示
在这里插入图片描述

design = ~group：这定义了实验的分组情况
colData = colData：这是一个数据框，包含样本的列信息（例如，样本名、组别等）。
assays = dat：count表达矩阵，行代表基因，列代表样本。

先筛选掉低表达的基因（为了尽量避免低表达基因导致的假阳性结果），之后估计每个样本的大小因子（大小因子是用于校正不同样本之间测序深度差异的一种方法，以确保在进行基因表达比较时能够公平地比较不同样本）。

dds <- dds[rownames(counts(dds)) > 1, ] # 过滤掉在任何样本中计数都小于或等于1的基因。
dds <- estimateSizeFactors(dds) # 估计每个样本的大小因子

estimateSizeFactors函数会根据每个样本的测序数据（通常是基因表达计数数据）来计算一个系数，这个系数反映了该样本相对于其他样本的测序深度，这个系数就是大小因子。

具体来说，DESeq2首先会对原始的表达量矩阵进行log转换，然后计算每个基因在所有样本中的均值。接下来，对于每个样本，它会将该样本中每个基因的表达量减去对应的所有样本中的均值，然后取中位数。最后，通过对这些中位数进行指数运算，得到每个样本的大小因子。

一旦计算出了每个样本的大小因子，就可以将其用于归一化原始的表达量数据。

归一化的目的：是消除不同样本之间由于测序深度差异而导致的偏差，使得不同样本之间的基因表达数据可以更加公平地进行比较和分析

之后通过DESeq函数用归一化后的数据进行差异表达分析

dds <- DESeq(dds)

最后提取差异表达分析的结果，并将其转换成数据框

res <- results(dds, contrast = c("group","control","disease"))
DEG <- as.data.frame(res)

注：results函数中contrast参数来指定比较时，第二个元素（在这个例子中是"control"）通常是被用作参考组或基线组，而第三个元素（在这个例子中是"disease"）则是用来和参考组进行比较的组。（换句话说，"control"是被比较的组，而"disease"是用来比较的组）

举个栗子：如果某个基因在"disease"中的表达量高于在"control"中的表达量，那么它的log2倍数变化将是一个正值

DEG 如下图所示：

baseMean: 这一列显示的是每个基因在所有样本中的平均表达量，经过大小因子校正后的值。它反映了基因的总体表达水平。
log2FoldChange: 这一列展示的是基因表达的对数2倍变化值（log2 fold change），正值表示在disease中表达上调，负值表示在disease中表达下调。
lfcSE: 这一列是log2FoldChange的标准误差估计值，它提供了log2FoldChange估计的不确定性度量
stat: 这一列是基因表达变化的统计检验值，用于衡量基因表达变化的显著性。一个大的正值或负值表示基因表达的变化是否显著。
pvalue: 这一列显示的是基因表达变化的p值，用于评估观察到的效应（如基因表达的变化）是否可能是由于随机误差引起的，通常认为P < 0.05则结果是显著的。
padj: 这一列是调整后的p值，用于控制假阳性率（简单说就是矫正后的P值）

在这里插入图片描述

给差异分析结果添加上下调标签

DEG$change <- as.factor(
  ifelse(DEG$pvalue < 0.05 & abs(DEG$log2FoldChange) >= 0.5,
         ifelse(DEG$log2FoldChange > 0.5,'Up','Down'),'Not')) 
table(DEG$change)
DEG_write <- cbind(symbol = rownames(DEG), DEG)

处理好的 DEG_write 如下图所示，除了新添加的symbol和change，其余与DEG一样，change列中: （筛选条件：|log2FoldChange| >= 0.5 & p.value < 0.05）

Up 表示上调基因
Down 表示下调基因
Not 表示未通过筛选的基因

在这里插入图片描述
筛选出表达具有差异的基因 （筛选条件：|log2FoldChange| >= 0.5 & p.value < 0.05）

sig_diff <- subset(DEG, DEG$pvalue < 0.05 & abs(DEG$log2FoldChange) >= 0.5)
sig_diff_write <- cbind(symbol = rownames(sig_diff), sig_diff)

sig_diff_write 与DEG_write的差别就是少了那些没有差异的基因。

最后，保存差异分析的结果：

write.csv(DEG_write, file = paste0('DEG_all.csv'))
write.csv(sig_diff_write, file = paste0('DEG_sig.csv'))

3. 结语

以上就是DESeq2差异分析的所有过程，如果有什么需要补充或不懂的地方，大家可以私聊我或者在下方评论。

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