近日，徐州市中心医院（徐州医科大学徐州临床学院）史振铎等为第一作者、韩从辉教授为通讯作者在《Biomarker Research》杂志发表题为“Integrative multi-Omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome of recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression”的研究论文，该研究通过全外显子组测序、简化基因组甲基化测序（RRBS）+氧化简化基因组甲基化测序（oxRRBS）及对应的转录组测序（RNA-seq）等多组学方法揭示了复发性膀胱癌的甲基化和羟甲基化水平及相关转录变化，并鉴定出用于预测PD-L1表达的生物标志物。深圳市易基因科技为本研究提供oxRRBS+RRBS和RNA-seq测序服务。

标题：Integrative multi-Omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome of recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression

时间：2023-01-13

期刊：Biomarker Research

影响因子：IF 8.633

技术平台：RRBS、oxRRBS、RNA-seq、全外显子组测序等

研究摘要：

背景：膀胱癌（Urinary bladder cancer，UBC）是泌尿系最常见的恶性肿瘤之一，但其高复发率和对免疫治疗的响应机制仍不清楚，导致临床结果预测困难。表观遗传学变化（尤其是DNA甲基化）在膀胱癌进展中起着重要作用，且越来越多地作为诊断或预后预测的生物标志物进行研究。然而，由于此前传统的亚硫酸盐测序方法（RRBS）不能区分5mC和5hmC信号，导致关于羟甲基化知之甚少。

方法：本研究使用多组学方法来绘制了原发性和复发性膀胱癌的基因组、转录组、DNA甲基化组和羟甲基化组图谱。

结果：本研究通过全外显子组测序鉴定出参与UBC进展的的基因突变（如FGFR3、KDMTA和KDMT2C），然而这些基因突变中与UBC复发或PD-L1下调几乎不相关。整合RRBS和oxRRBS-seq数据，鉴定出在复发性膀胱癌中显著富集5hmC相关转录变化的脂肪酸氧化相关基因。在PD-L1高表达的膀胱癌样本中发现NFATC1（一种高度参与T细胞免疫应答的基因）基因体中存在5mC低甲基化DMR。由于全基因组中的5mC和5hmC变化呈负相关，因此仅基于RRBS数据结合了5mC和5hmC信号，减弱了癌症相关信号标记，不适合用作临床生物标志物。

结论：通过UBC样本的多组学分析，结果表明表观遗传变化比基因突变更多参与UBC复发和PD-L1调节，证明了使用DNA甲基化标记物预测膀胱癌患者免疫治疗反应的潜力。研究还表明仅仅采用RRBS方法联合检测5mC和5hmC水平会降低表观遗传生物标志物的预测准确性，揭示了使用oxRRBS-seq进行甲基化标记发现的优势。

项目设计：

（1）样本选取：

选取行腹腔镜膀胱根治术（LRC）、膀胱部分切除术（PC）或经尿道膀胱肿瘤切除术（TURBT）的膀胱癌患者组织样本，采集膀胱肿瘤组织和癌旁组织。手术后立即用无菌生理盐水清洁组织，并储存在-80°C以进行检测。共采集45例患者膀胱组织标本45份，其中膀胱癌组织45份，癌旁组织18份。

（2）项目设计流程图：

结果图形

图1：单碱基分辨率对膀胱癌样品进行5mC和5hmC分析。

（A） 在膀胱癌样品中鉴定出的显著5mC和5hmC DMR数量。

（B） 5mC和5hmC DMR的基因组注释。

膀胱癌中5mC hyper DMR（C）和5mC hypo DMR（D）的通路富集。

膀胱癌中5hmC hyper DMR（E）和5hmC hypo DMR（F）的通路富集。

图2：复发性膀胱癌的5mC和5hmC分析。

（A） 在复发性膀胱癌样品中鉴定出的5mC和5hmC DMR的数量（左），5mC和5hmC DMR的基因组注释（右）。

（B） RNA-seq用5hmC DMR标准化脂肪酸代谢相关基因数量。

（C） 对TUGB1和EZHIP DMR的5mC和5hmC特异性qPCR验证。

（D和E）复发性膀胱癌中的差异甲基化谱与组织收集后发生复发性UBC的5名患者之间的相关性。

图3：PD-L1高表达膀胱癌症的甲基化变化。

（A） PD-L1高表达膀胱癌症样本中鉴定的5mC和5hmC DMR数量（左），5mC和5hmC DMRs的基因组注释（右）。

（B） PD-L1高表达膀胱癌症样本中5mC DMR生物标记物的甲基化变化热图。

（C） PD-L1高表达膀胱癌中差异性5hmC水平和差异性5mC水平之间的相关性散点图。

图4：利用5mC生物标志物预测免疫治疗反应。

（A） TET基因的5mC、5hmC和RRBS甲基化水平变化。

（B） TET 基因的5mC、5hmC和RRBS甲基化预测PD-L1高表达的膀胱癌AUC评分。

（C） 注释到NFATC1的5mC DMR轨迹图（左），预测PD-L1高表达膀胱癌的一种NFATC1-DMR预测AUC评分（右）。

总结：

本研究采用改进的全基因组DNA甲基化和DNA羟甲基化图谱绘制方法，将氧化还原代表性亚硫酸盐测序（oxRRBS）与传统RRBS相结合。oxRRBS可以实现5hmC至fC的选择性氧化。羟甲基化水平可以通过从RRBS中减去从oxRRBS获得的亚硫酸盐测序信号来确定。因此，可以使用RRBS+oxRRBS分别计算精确的5mC和5hmC水平，从而以更高的分辨率提供更详细的表观遗传学信息，更适合用作膀胱癌诊断和预后的生物标志物。

关于易基因精准DNA甲基化/羟甲基化测序（oxBS-seq）

羟甲基化5hmC是哺乳动物基因组上的第六碱基，在发育、衰老、神经退行性疾病、复杂疾病及肿瘤发生过程中起重要作用。DNA羟甲基化是近年发现的一种新的DNA修饰并迅速成为研究热点。随着研究的深入，发现之前被认为是检测DNA甲基化标准的重亚硫酸盐测序并不能区分DNA甲基化（5mC）和DNA羟甲基化（5hmC）。

易基因联合剑桥大学建立了化学氧化法结合重亚硫酸盐转化的测序技术（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），该技术不仅可以精确检测DNA甲基化，排除DNA羟甲基化的影响，还可以双文库结合同时单碱基分辨率精确检测DNA羟甲基化。

传统BS转化无法区分5mC和5hmC

传统的Bisulfite测序中，5hmC经过Bisulfite处理后变为CMS，CMS在测序中仍然被读作C碱基，因此不能区分5mC和5hmC。

oxBS技术原理

技术优势：

• DNA甲基化检测全新的“标准”；
• 单碱基检测DNA羟甲基化修饰；
• 多重质控标准检测氧化效率和Bisulfite转换率；
• 实验偏好性低，重复性高（R2＞0.98）；
• 易基因自主研发的甲基化特异性多重PCR引物设计软件；
• 可满足多种测序应用需求：
• 全基因组氧化甲基化测序（oxWGBS）
• 简化基因组氧化甲基化测序（oxRRBS）
• 目标区域靶基因氧化甲基化测序（Target-oxBS）。

技术路线：

技术指标：

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，技术详情请致电易基因0755-28317900。

参考文献：

Shi ZD, Han XX, Song ZJ, Dong Y, Pang K, Wang XL, Liu XY, Lu H, Xu GZ, Hao L, Dong BZ, Liang Q, Wu XK, Han CH. Integrative multi-omics analysis depicts the methylome and hydroxymethylome in recurrent bladder cancers and identifies biomarkers for predicting PD-L1 expression. Biomark Res. 2023 May 3;11(1):47.

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