Neuro-Oncology | IF:15.9 CUTTag和RNA-seq联合解析胶质母细胞瘤的耐药性

发表单位：德克萨斯大学圣安东尼奥分校

发表日期：2023年1月18日

期刊：Neuro-Oncology（IF: 15.9）

研究技术：CUT&Tag-seq、RNA-seq、RT-qPCR（爱基百客均可提供）

2023年1月18日德克萨斯大学圣安东尼奥分校Gangadhara R. Sareddy研究团队在期刊Neuro-Oncology（IF:15.9）发表了题为《Lysine-specific histone demethylase 1A (KDM1A/LSD1) inhibition attenuates DNA double-strand break repair and augments the efficacy of temozolomide in glioblastoma》的研究论文。该研究结果表明抑制赖氨酸特异性组蛋白去甲基酶1A（KDM1A）可减弱DNA双链断裂修复通路，并增强替莫唑胺(TMZ)介导的胶质瘤干细胞DNA损伤，与单一治疗相比，KDM1A抑制剂和TMZ联合治疗可提高荷瘤小鼠的生存率。

01 研究背景

胶质母细胞瘤(GBM)仍然是最常见和最致命的恶性原发性脑肿瘤，目前5年生存率为7.2%。标准治疗包括手术切除大块肿瘤，然后进行体外放射治疗和TMZ辅助化疗。胶质瘤干细胞(Glioma stem cells, GSCs)具有良好的DNA修复能力，能够有效地修复标准治疗引起的DNA损伤，从而产生耐药性。表观遗传修饰因子KDM1A/LSD1在胶质母细胞瘤中高表达，然而，KDM1A在TMZ耐药中的作用机制仍然不清楚。

02 研究思路

03 研究结果

1. 敲低KDM1A可增强TMZ在降低GSCs活力、神经球形成和自我更新中的作用

在许多癌症类型中，KDM1A在致瘤性和干性中的重要性已得到强调。在胶质瘤中，与KDM1A低表达人群相比，KDM1A高表达患者的总生存率较低，此外，与非肿瘤样本相比，GBM患者肿瘤表达更高水平的KDM1A。重要的是，在接受标准TMZ/IR治疗的患者中，作者观察到，与有反应的患者相比，无反应的患者表现出更高水平的KDM1A(图1A)。进一步分析表明，与原发肿瘤相比，KDM1A在复发的GBM样本中高表达(图1B)。

作者建立了从德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心（UTHSA）的GBM患者样本中获得的GSCs的集合。使用这些样本，作者检查了KDM1A是否与耐药表型相关。为了检验这一假设，作者用对照或2种不同的KDM1A特异性shRNA转导患者来源的GSCs，并用增加剂量的TMZ处理它们。细胞活力测定结果显示，与对照相比，KDM1A敲低使GSCs对TMZ敏感（图1C-D)。此外，与各自的对照或单一治疗相比，KDM1A敲低可减少TMZ治疗的GSCs的神经球形成（图1E-F）、神经球生长（图1G-H）和自我更新能力（图1I-J）。重要的是，使用诱导型CRISPR/Cas9系统生成的KDM1A敲除(KO) GSCs验证了这些发现。细胞活力测定结果表明，KDM1A-KO显著使GSCs对TMZ治疗敏感。有趣的是，在KDM1A-KO细胞中重新引入KDM1A显著逆转了这种效应。此外，作者使用已知TMZ敏感（U251）、TMZ耐药（T98G）和获得性TMZ耐药（U251 TMZ-R）GBM系的细胞活力和克隆生成研究验证了这些发现。总之，这些发现表明KDM1A与耐药表型相关，并且KDM1A基因敲低增强了TMZ在GSCs的疗效。

图1. KDM1A敲低使GSCs对TMZ治疗敏感

2. NCD38是一种脑渗透性KDM1A抑制剂，可增强TMZ在GSCs中的疗效

最近，作者的研究小组发现了一种新的KDM1A特异性抑制剂NCD38，它比其母体化合物2-PCPA更有效地选择性抑制KDM1A，并在几种癌症模型中显示出抗肿瘤活性。接着作者在雄性Sprague Dawley大鼠中静脉注射(IV)和口服NCD38后进行了药代动力学和脑生物利用度研究。两种给药途径均显示出良好的NCD38在血浆中的药代动力学参数(图2A)，口服的生物利用度为23%，每个病例的半衰期接近2小时(图2A)。重要的是，NCD38在大脑和血浆中均可获得(图2B, C)，在静脉注射和口服给药后8小时，总脑/血浆比率超过2，表明NCD38易于渗透血脑屏障（BBB）并表现出足够的脑生物利用度。此外，作者使用U251-GSC原位小鼠模型进行了剂量范围(1mg/kg, 5mg/kg或10mg/kg)的研究。结果显示，10mg/kg是抑制肿瘤生长最有效的剂量(图2D)。

接下来，作者研究了KDM1A特异性抑制剂NCD38是否会增强TMZ介导的细胞活力降低。与KDM1A敲低相似，NCD38处理的GSCs对TMZ的敏感性高于单独治疗。接下来，作者研究了KDM1A特异性抑制剂NCD38是否增强了TMZ介导的细胞活力降低。与KDM1A基因敲除相似，NCD38处理的GSCs对TMZ的敏感性高于单独使用TMZ(图2E，F)。联合指数分析表明，NCD38处理与TMZ具有协同作用。重要的是，KDM1A的敲除显著降低了GSCs中NCD38的活性。此外，与单一治疗相比，联合治疗显著降低了GSCs的自我更新和神经球形成能力(图2G-L)。这些结果表明，NCD38与TMZ协同作用，降低了GSCs的活力和自我更新。

图2. 脑渗透性KDM1A抑制剂 NCD38可协同增强TMZ介导的细胞活性和GSCs自我更新的降低

3. KDM1A富集于DNA DSB修复基因的转录起始位点

为了了解KDM1A抑制如何使GSCs对TMZ敏感的机制，作者使用CUT&Tag-seq进行了GSCs中KDM1A的全基因组定位研究。作者在GSCs基因组中检测到75491个KDM1A峰(P<0.0001)(图3A)。在这些峰中，大多数(49.11%)位于启动子区域。具体来说，36.6%位于转录起始位点两侧的1kb区域，KDM1A峰位于基因间区和内含子区域，分别占18.57%和29.29%。重要的是，利用GO对KDM1A结合基因进行通路分析显示，KDM1A结合基因在DNA修复、细胞周期和UPR信号通路中富集(图3B)。由于TMZ抗性表型与DNA修复增强有关，作者接下来检查了DNA修复基因上KDM1A特异性富集。作者的研究结果表明，KDM1A在许多DNA修复基因的转录起始位点高度富集。作者用ChIP验证了KDM1A与特定基因启动子的结合，表明KDM1A可能通过直接募集到启动子区域来调节它们的表达。

图3. CUT&Tag和RNA-seq分析发现KDM1A抑制可抑制DNA修复基因的表达

4. KDM1A抑制或敲除减少参与DNA修复的基因的表达

由于GSCs具有较高的DNA修复能力，这是TMZ治疗耐药的主要因素，作者假设KDM1A抑制介导的TMZ敏感性可能与DNA修复基因的衰减有关。作者通过RNA-seq检测了使用载体、NCD38或TMZ单一疗法或两者联合处理的GSCs的整体转录变化。作者首先研究了NCD38单药治疗的效果，以及NCD38治疗的GSCs中与DNA修复和细胞周期相关的下调途径(图3C)。对差异表达基因的进一步检查显示，几个重要的DNA修复基因下调(图3D-E)。重要的是，GSEA分析表明，NCD38处理的细胞中改变的基因与HR和NHEJ修复途径的基因集呈负富集(图3F-G)。进一步分析表明，NCD38处理增加了DNA修复基因子集启动子区域抑制性组蛋白甲基化标记H3K9me2的富集。

为了进一步验证KDM1A对GSCs中DNA修复途径的影响，作者使用KDM1A-KO GSCs进行了RNA测序，并将其与NCD38处理的细胞进行了比较。结果表明KDM1A-KO、KDM1A-KD和KDM1A抑制都会导致GSCs中DNA DSB修复基因的下调。作者还观察到，与NCD38组相比，KDM1A-KO组有更多的基因发生改变，这可能在一定程度上反映了KDM1A以去甲基酶依赖和独立的方式调节基因表达的能力，而NCD38只抑制KDM1A去甲基酶依赖的基因表达。

为了进一步了解NCD38和TMZ在GSCs中联合作用的机制基础，通过无监督聚类将差异表达基因细分为4个主要簇。A3簇包含140个由TMZ诱导但被NCD38抑制的基因。GO分析表明，这些基因主要富集于细胞对DNA损伤刺激的反应、DNA重组、DNA修复和HR(图3I)。A4簇包括420个由NCD38和TMZ联合处理协同诱导的基因，涉及细胞死亡和自噬。此外，A2簇包括646个在联合治疗中协同抑制的基因，其中一些涉及细胞周期、上皮向间质转化、E2F、mTORC1和MYC信号传导。总之，这些结果表明，KDM1A的抑制有助于DNA修复基因的衰减。

5. KDM1A抑制可抑制GSCs中的HR和 NHEJ

由于RNA-seq和CUT&Tag-seq结果表明KDM1A在DNA DSB修复中发挥作用，作者检查了KDM1A抑制对GSCs DNA修复能力的影响。先前的研究表明，HR和NHEJ修复能力是GBM治疗耐药的原因。为了确定KDM1A敲低或抑制对HR和NHEJ修复试验的影响，作者首先在GSCs中使用了基于qPCR的HR测定(图4A)，发现KDM1A敲除或抑制显著降低了GSCs中的HR能力(图4B-D)。接下来，在U2OS和HeLa细胞系中使用众所周知的HR特异性DR-GFP报告系统测量HR效率(图4E)。在这些模型中，KDM1A敲低或NCD38处理也显著降低了HR效率(图4F-J)。此外，作者探讨了NHEJ能力是否受到KDM1A敲低或抑制的影响(图4K)。正如测序结果所预测的那样，敲低或抑制KDM1A会降低GSCs的NHEJ能力(图4L-O)。总之，这些结果高度表明KDM1A促进了GSCs的HR和NHEJ修复活性。

图4. KDM1A抑制会减少GSCs的同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)修复

6. KDM1A抑制增强TMZ介导的GSCs DNA损伤

由于KDM1A抑制损害了GSCs的DNA修复能力，作者接下来研究了这种HR和NHEJ修复能力的衰减是否会导致持续的DNA损伤信号传导和未修复的双链断裂。首先，作者测量了KDM1A敲低、敲除和NCD38与TMZ联合处理的GSCs中γH2AX焦点的形成。在基础条件下，敲低KDM1A增加了γH2AX水平(图5A）。与对照shRNA细胞相比，TMZ进一步处理显著增加了KDM1A KD细胞中的γH2AX水平，这在NCD38和TMZ联合处理中得到了证实(图5A, B)。此外，敲低或药物抑制KDM1A显著增加了GSCs中γH2AX焦点的形成(图5C-F)。

接下来，作者评估了RAD51病灶的形成，这是一种HR修复的标记物，其抑制作用会使胶质瘤细胞对烷化剂敏感。正如预期的那样，TMZ治疗促进了RAD51病灶的形成，然而，当与NCD38联合处理时，观察到TMZ诱导的GSCs中RAD51病灶的形成明显减弱，这与测序结果一致，并支持NCD38损害HR的作用(图5E-G)。此外，评估了53BP1病灶的形成，这是NCD38处理后GSCs中DNA DSB修复和NHEJ的标志，发现TMZ处理增加了53BP1病灶的形成，然而，当与NCD38联合处理时，发现TMZ诱导的53BP1病灶形成的明显衰减，这与作者的报告分析一致，支持NCD38减少GSCs中NHEJ修复的作用。此外，通过碱性彗星试验测量了联合治疗对DNA损伤的影响，发现与单一治疗相比，联合治疗显著增加了处理过的GSCs的橄榄尾矩(图5H-K)。因此，这些结果提供了强有力的证据，即KDM1A抑制降低了GSCs修复TMZ介导的DNA损伤的能力。

图5. KDM1A抑制增强GSCs中TMZ介导的DNA损伤

7. KDM1A敲低或抑制可增强TMZ在异种移植模型中的疗效

为了确定KDM1A是否是增强TMZ疗效的潜在靶点，作者将经对照shRNA或KDM1A shRNA转导的患者来源的GSCs注射到NOD-SCID小鼠的右脑(图6A)。结果发现，与对照组相比，TMZ治疗显著降低了肿瘤进展，提高了KDM1A敲低的荷瘤小鼠的存活率(图6B-C)。接下来，为了确定KDM1A抑制剂NCD38与TMZ联合使用是否能提高总生存时间，作者用NCD38、TMZ或联合治疗患者来源的GSC 040815、GSC 082209和U251 GSCs荷瘤小鼠。如图所示，与单一治疗相比，NCD38和TMZ联合治疗在所有肿瘤模型中均可显著降低肿瘤进展(图6D)，并提高总生存时间(图6E, F)。肿瘤切片免疫组化分析显示，联合治疗后，增殖标记物Ki67显著降低(图6G-H)，凋亡标记物cleaved caspase3和DNA DSB标记物γH2AX显著增加(图6G, I-J)，这些发现与使用KDM1A敲低肿瘤样本获得的数据一致。这些结果表明，KDM1A基因敲低或抑制剂处理显著增强了TMZ的疗效，并改善了GSCs荷瘤小鼠的总生存时间。

为了进一步了解KDM1A在人GBM样本DSB修复中的临床关联，作者分析了公开可用的TCGA患者数据库。KDM1A与几种DNA修复基因之间存在正相关关系，但是这些基因在NCD38处理后被减弱，包括EXO1、RAD51和BRCA1(图6K-M)。有趣的是，不仅在GBM中，而且在其他几种癌症类型中也观察到类似的趋势(图6N)。总之，这些数据提供了临床前证据，表明KDM1A抑制增强了TMZ在提高小鼠GBM模型存活率方面的功效。