文献阅读：猕猴的单个基底外侧杏仁核神经元表现出与额叶皮层不同的连接模式

文献介绍

「文献题目」 Single basolateral amygdala neurons in macaques exhibit distinct connectional motifs with frontal cortex
「研究团队」 Peter H. Rudebeck（美国西奈山伊坎医学院）
「发表时间」 2023-10-18
「发表期刊」 Neuron
「影响因子」 16.2
「DOI」 10.1016/j.neuron.2023.09.024

摘要

基底外侧杏仁核（Basolateral amygdala, BLA）广泛投射到猕猴额叶皮层（frontal cortex），而杏仁核-额叶投射对于适当的情绪反应和决策至关重要。虽然人们认识到单个 BLA 神经元会分支并投射到额叶皮层的多个区域，但这种分支的组织和频率尚未完全表征。在这里，作者确定了 3000 多个猕猴 BLA 神经元的投射模式。作者发现三分之一的 BLA 神经元在额叶皮层和皮层下结构中有两个或多个不同的投射目标。单个 BLA 神经元投射到多个区域的模式被组织成重复的 motifs，靶向内侧和腹侧额叶皮层中的不同区域组，表明可分离的 BLA 网络。作者的研究结果开始揭示非人类灵长类动物大脑中单神经元连接的丰富结构，为 BLA 在协调全脑对情感刺激的反应中的作用提供了神经解剖学基础。

研究结果

MAPseq 使用 sindbis 病毒载体感染神经元，使其产生独特的 RNA 条形码。该方法的工作原理是，单个神经元最有可能只吸收编码独特 mRNA 条形码的单个病毒颗粒。这些 mRNA 条形码与非功能性突触前蛋白结合，因此在细胞体中表达，并沿着轴突运输到突触末端。然后，通过对注射位点和靶位点的样本进行解剖和测序，单神经元投射模式可以通过比较每个样品中发现的条形码列表来确定。

1. MAPseq 在猕猴中的验证

作者在两只猕猴的 BLA 中进行双侧 MRI 引导立体定向注射带条形码的辛德比斯病毒（Figure 1A）。灌注后，提取大脑，分离半球并切片。BLA 和额叶皮层（frontal cortex）、纹状体（striatum）、内嗅皮层（entorhinal cortex）、海马体（hippocampus）和丘脑内背侧核（MD）中的目标区域被解剖，根据灰质/白质边界以及脑沟标志（Figure 1B）。选择这组区域是因为它包含 BLA 到额叶皮层的主要投射目标。值得注意的是，因为选择了可能目标区域的子集（例如，作者没有剖析来自更多尾侧颞叶皮层的目标），不一定捕获每个测序神经元投射的完整范围。相反，所有结论均仅基于此处描述的一组目标。

(A)左图：注射方法示意图。右图：在冠状图谱上标注的实际注射部位（耳间距离单位为 mm）。在前部切片（19.5 mm）中，每只动物只在一个垂直轨道上进行注射；在后部切片（18 mm）中，每只动物在两个轨道上进行注射。半球 1 和 2（分别为红色和蓝色）来自一只动物，而半球 3 和 4 来自另一只动物（分别为黄色和绿色）。
(B)示例冠状切片显示纹状体以及额叶和颞叶的解剖靶点。Ento，内嗅皮层；HC，海马体（未显示）；AI，前纹状皮层；mOFC，眶上额皮质；lOFC，眶下额皮质；vlPFC，腹外侧前额叶皮质；scACC，前扣带前部；pgACC，周围带前扣带前部；dACC，背扣带前部；PMd，背侧运动皮质；NAcc，伏隔核；MD，中背核（同样未显示）。前后水平相对于耳间平面以 mm 为单位。
(C)barcode 计数相对于注射部位最大值在非注射部位杏仁核样本（蓝色）、所有靶结构（绿色）以及小脑对照部位（红色）中的分布。在杏仁核内表达的 barcode 显著多于远端靶点位点，而在靶点位点表达的条形码显著多于小脑对照组织，而杏仁核与小脑之间存在非常低的投射概率。
(D)每个 target 和 control 区域中 barcode 的比例；虚线表示在 control 区域中发现的 barcode 比例。
(E)在杏仁核外的零个（绿色）、一个（橙色）、两个（蓝色）或两个以上（红色）的靶标的唯一 barcode 比例。
(F)对于 10 个唯一 barcode（彩色线），在所有潜在的 target 和 control 区域中的 barcode 比例归一化。
(G)barcode 在区域 A 中同时也在区域 B 中被发现的条件概率。请注意，此处索引的顺序会改变 P(A|B) 大于 P(B|A) 的概率。

作者使用生物分析仪确认了组织样本中 RNA 的完整性，然后使用 qPCR 来确认条形码表达与管家基因相比是稳健的（Figure S2）。正如预期的那样，与来自额叶皮层的样本相比，作者在注射部位附近的杏仁核样本中恢复了明显更多的条形码，并且与来自小脑的对照样本相比，在额叶皮层中恢复了更多的条形码（Figure 1C)。作者特别选择小脑作为对照位点，因为杏仁核极不可能投射到大脑的这一部分。因此，条形码 mRNA 在猕猴神经元中表达，然后被转运到额叶皮层和其他大脑区域的轴突末端。

然后对从 BLA 和目标区域提取的 mRNA 进行高通量下一代测序。将提取的 RNA 中的独特条形码计数标准化为 spike-in 序列（即，添加到每个样本中的已知 RNA 序列以控制样本之间的 PCR 效率），并应用阈值来控制虚假测序结果（Figure S3）。然后对四个半球的组合阈值条形码计数进行分析（分别参见 Figures S4 和 S5，分别对每个半球进行分析以及半球之间的比较）。

作者总共在四个半球的 BLA 解剖样本中恢复了 3,115 个独特的条形码。该条形码计数的水平与每次注射在小鼠中恢复的水平相似。这表明 MAPseq 在猕猴大脑中按预期发挥作用。作者还进行了一项额外的对照分析，以评估数据是否显示出任何证据表明单个神经元可能会吸收多个病毒颗粒。MAPseq 的工作原理是，这种情况极不可能发生，但尽管如此，作者还是对所有样本中两个条形码具有完全相同表达的频率进行了分析。在符合阈值的条形码中，3,115 个中只有 10 个（0.32%）具有相同的表达模式。这表明 Sindbis 载体主要用单个条形码序列感染单个神经元，因此 MAPseq 在猕猴中的作用与在小鼠中的作用类似。

每个目标大脑区域中恢复的条形码的总体比例（Figure 1D）反映了猕猴 BLA 的已知连接。在内嗅皮层（ento）和伏隔核 (NAcc) 中回收到的条形码数量最多，这两个区域之前已被确定为接受 BLA 的密集投射。从海马体（HC）和无颗粒岛叶 (AI) 中回收到的条形码数量较少，这两个区域也有充分记录表明收到了 BLA 的强烈投射；其次是胼胝体下前扣带皮层 (scACC) 和背侧前扣带皮层 (dACC)，在少数几个杏仁核投射定量研究之一中，发现这些区域在额叶区域中接收最强的杏仁核输入。值得注意的是，从额叶皮层和纹状体的所有其他目标区域中恢复了数量相对相似的条形码，这再次与额叶上 BLA 连接的已知梯度相匹配。因此，条形码 mRNA 的恢复以及作者的发现与之前的纤维束追踪之间的一致性支持 MAPseq 用于量化猕猴区域间投射的有效性。

为了开始确定从 BLA 中假定的单个神经元到多个区域的投射范围，作者随后确定了 BLA 中发现的每个条形码在目标区域中的所有样本分支后是否存在于任何目标大脑区域中。大约三分之一的独特条形码（可以解释为代表单个神经元）仅在杏仁核内的样本中发现。作者将这些称为“zero targets”。这些细胞可能是杏仁核内的中间神经元，也可能是投射到本次分析中未包括的目标区域的细胞，例如前颞叶的部分区域。另外三分之一的细胞仅投射到收集的目标区域之一。作者将这些神经元称为具有“specific”投射（即，特定于评估的一组目标区域）。最后，剩下的三分之一在杏仁核之外有两个或更多目标。作者将这些具有多个目标的神经元称为具有“branching”投射（Figure 1E）。因此，作者发现投射到杏仁核之外的三分之二的 BLA 神经元中，有一半分支神经支配额叶皮层的多个位置。分支的可能性明显高于先前基于单个轴突追踪的估计，突显了 MAPseq 高通量和多重功能的独特贡献。

2. 单个 BLA 神经元分支连接模式的定量分析

先前对单神经元投射到多个皮质区域的模式的分析受到可追踪的神经元数量或可评估的目标数量的限制。然而，MAPseq 克服了这个问题，因为它可以揭示单个神经元与多个大脑区域的连接（Figure 1F）。因此，作者接下来研究了在一个目标结构中找到的条形码也在另一目标结构中找到的概率（Figure 1G）。这种方法使我们能够开始确定单个 BLA 神经元的连接特定于单个区域或分支到多个区域的程度。如 Figure 1G 所示，BLA 神经元通常针对额叶皮层的多个位置。例如，投射到 NAcc 的 BLA 神经元也有很高的概率投射到额叶皮层的所有部分，尤其是 AI 皮层。相比之下，投射到 AI 的单个 BLA 神经元不太可能投射到内嗅皮层（ento）或海马体（HC）。类似的非重叠投射模式在额叶皮层的 BLA 投射中也很明显。例如，投射到内侧眶额皮质 (mOFC) 的神经元不太可能投射到腹外侧前额皮质 (vlPFC)。

值得注意的是，这些投射到两个区域的模式与两项研究的结果密切对应，这两项研究调查了 BLA 神经元分支到额叶皮层和丘脑的模式。Sharma、Fudge 和同事的一项研究确定了一组杏仁核神经元，它们投射到内侧额叶区域 25/14（分别对应于本文的 scACC 和 mOFC 区域）和 32/24（对应于本文的 pgACC 和 dACC 区域）。作者的 MAPseq 结果识别出了投射到这两个区域的神经元，尽管与之前的工作 (7%–10%) 相比，作者发现投射到这两个区域的神经元比例 (7%–20%) 略高。这种差异可能反映了这样一个事实：与相对集中的逆行示踪剂注射相比，本文的解剖区域包含了内侧额叶皮层的更大部分。作者还发现了与 Timbie 和 Barbas 报告的结果高度相似的结果，他们发现了两个不重叠的杏仁核神经元群，它们投射到 MD 或后 OFC/AI（Figure 1G）。正如本文的 MAPseq 分析所表明的，这种分支的缺乏是一个重要的发现。这是因为它表明该技术能够揭示对某些目标的分支投射和特定投射的预期模式。总而言之，这些分析提供了证据，表明 BLA 神经元经常投射到额叶皮层中的多个目标，这反驳了特定目标或一对一靶标作为主要的连接原则。

先前对神经元分支到两个目标的条件概率的分析（Figure 1G）虽然揭示了这一点，但并未捕获单个 BLA 神经元与多个区域建立的完整连接，这是 MAPseq 相对于标准纤维束追踪方法的主要优势之一。因此，作者接下来的分析重点是近 1,300 个 BLA 神经元，这些神经元的投射分支到额叶皮层、颞叶皮层、纹状体和丘脑的多个位置（Figure 2A）。虽然所有目标区域都接收到来自分支到多个区域的神经元的大部分输入，但内嗅皮层接收到的来自 BLA 的投射比例最高，这些投射是特定的且仅针对该区域（Figure 2B）。这种差异可能与作者评估的唯一皮质颞叶区域有关。

(A)1,300 个神经元的 K-means 聚类，这些神经元投射到杏仁核之外的多个区域 (k = 12)。
(B)来自特定（×）或分支（实心圆圈）投射的 BLA 到额叶皮层区域、纹状体和内侧丘脑的投射比例。
(C)分支模式的零分布计算逻辑。
(D)观察到的（蓝色）和预期的（绿色）神经元计数，并投射到多个区域（顶部）。按区域（底部）划分的特定过多（红色）或过低（蓝色）分支模式。
(E)具有 2 个（奶油色）、3 个（灰色）和 4 个（绿松石色）目标区域的所有可能分支模式的概率火山图。正效应大小表示与零分布相比代表性过高，负效应大小表示代表性过低。红色虚线标记了统计显着性水平，因此在错误发现率 (FDR) 校正后，其上方的任何点都明显过高或过低。用黑色箭头和红色轮廓标记的点指的是 NAcc 和 AI 之间的分支模式。
(F)显着过高（红色）和过低（蓝色）2-、3- 和 4-target 区域分支模式的比例。

接下来，作者试图确定与机会分布相比是否有任何分支模式被过度代表或不足。首先，作者将这些分支模式的频率与基于投射到每个区域的统一可能性的零分布进行比较；假设分支完全独立，神经元投射到区域 A 和 B 的概率可以计算为投射到区域 A 和区域 B 的独立概率的乘积。因此，对于两个区域有 120 个可能的独特 BLA 分支模式，其中每个模式的预期概率将为 0.0083；560 个独特的三分叉（trifurcating）模式导致预期概率为 0.0018，43,860 个独特的四分叉（quadfurcations）模式导致概率为 0.000023。该分析的结果显示在 Figure S6 中，它们表明包含从 BLA 接收更强输入的区域（如内嗅皮层）的模式更有可能被发现被过度代表。为了更好地回答这个问题并考虑从 BLA 到每个目标区域的不同投射强度，作者构建了另一个零分布，该分布基于数据中目标区域中条形码的整体分布（Figure 2C）。将每个模式的实际计数与基于条形码相对比例的零分布进行比较，作者仅识别出一个过度代表性的二分叉（bifurcating）模式：投射到 NAcc 和 AI 的神经元（二项式检验，p = 0.003；用黑色箭头和红色轮廓突出显示 Figure 2E）。该模式与主要低于代表的二分叉和三分叉一起被发现，其中许多包含包含 NAcc、内嗅皮层和海马体某些组合的投射模式（Figures 2D and 2E）。考虑到这些是数据中最有可能收到 BLA 投射的三个区域，仅分支到其中两个区域的频率低于预期，这有点令人惊讶（Figure 1E）。相比之下，与相同的机会分布相比，投射到四个不同目标区域的单个神经元更有可能被过度代表（Figure 2F）。换句话说，仅根据每个目标区域中发现的条形码比例，二分叉比预期要少，而具有四分叉的 BLA 神经元比预期要多。重要的是，该分析还表明，观察到的分支模式不仅仅是条形码分布的产物（即，内嗅皮层接收来自 BLA 的投射比例最高，但内嗅皮层的投射并不最有可能分支到多个区域）。相反，单个 BLA 神经元的分支似乎是高度结构化的。

3. 额叶皮层内的 BLA 单神经元投射网络

认识到 BLA 中单个神经元的投射很可能分支到多个区域，作者试图了解这些投射是如何组织的。在这里，作者分别关注单个 BLA 投射到额叶皮层接收最高密度连接的部分（即内侧和腹侧额叶皮层）的模式。此外，BLA 对这些区域的投射被认为在功能上是不同的；BLA 和内侧额叶皮层之间的相互作用与动物的防御性威胁条件反射、社会评价的各个方面以及人类 PTSD 等焦虑相关疾病密切相关。相比之下，从 BLA 到腹侧额叶皮层的投射更多通常与奖励引导行为相关，这些环路的功能障碍与成瘾性疾病有关。

4. 内侧额叶皮层

作者确定了 405 个 BLA 神经元投射到内侧额叶区域 scACC（area 25）、pgACC（area 32）、dACC（area 24）（Figure 3A）。尽管这些区域紧密相连，但作者发现它们收到的 BLA 投射的组织存在显着差异。首先，超过一半的投射到内侧额叶皮层的 BLA 神经元专门靶向 scACC (220/405)，而三分之一仅靶向 dACC (130/405；z 比例检验，z = 6.38，p < 0.0001)；甚至更少的 BLA 投射到内侧额叶皮层是靶向 pgACC 的（55/405；z = 6.28，p < 0.0001）（Figure 3B）。事实上，大多数靶向 pgACC 的 BLA 神经元也投射到内侧额叶皮质的其他部分，而一小部分 dACC 投射神经元在内侧额叶皮质内分支（z = 5.37，p < 0.0001）。scACC 投射神经元最不可能分支和支配内侧额叶皮层的其他部分（z = 3.17，p = 0.0015）。因此，在内侧额叶皮层内，存在特定与分支 BLA 连接的层次结构，其中 pgACC 接收的特定 BLA 输入最少，而 scACC 接收最多。

(A)示意图显示此处分析的三个内侧额叶皮层投射神经元群：靶向 scACC（蓝色）、pgACC（红色）、dACC（绿色）的 BLA 神经元。D 和 V 分别指背侧和腹侧方向； R 和 C 表示喙侧和尾侧。
(B)维恩图，说明了投射到每个内侧额叶皮层区域，同时也分支到其他两个区域；pgACC 投射神经元比 dACC 投射神经元更有可能分支（z test for proportions, z = 3.17, p = 0.0015），dACC 投射神经元比 scACC 投射神经元更有可能分支（z = 2.27，p = 0.023）。
(C)内侧额叶皮层投射神经元投射到非内侧额叶皮层目标的可能性。这里的神经元群是不重叠的，因此排除了在 scACC、pgACC 和 dACC 之间分支的神经元。

接下来，作者只关注投射到三个内侧额叶区域之一的神经元，而它们之间没有分支。作者这样做是为了评估不重叠的特定投射的结构。正如之前提到的，BLA 神经元往往有更多分支到多个区域的投射，而不是单个特定区域的投射（Figures 2C and 2E）。在这个分支中，作者发现了额外的结构。投射到 dACC 的神经元比投射到 pgACC 的神经元更有可能拥有四个 targets，投射到 pgACC 的神经元主要由投射到两个或三个 targets 区域的神经元主导（Figure S7B）。这些结果表明，虽然 pgACC 的大部分 BLA 输入在其他内侧额叶区域之间共享，但相同的输入很少广播到内侧额叶皮层以外的区域，这突出表明单个皮层区域可以同时接收高度共享和高度特异性的输入。

在从 BLA 到内侧额叶皮层的投射中，这些单个神经元发送分支投射的区域存在显着差异。虽然投射到每个内侧区域的 BLA 神经元与海马和内嗅皮层的分支比例相似（Figure 3C），但投射到 scACC 的神经元比其他区域更有可能投射到 NAcc。这种投射模式在单个神经元水平上很明显（Figure S7A），并且这些细胞也很可能与 AI 连接。然而，投射 dACC 的 BLA 神经元比内侧额叶皮质的其他部分更有可能投射到外侧 lOFC 和 vlPFC 位于额叶腹侧表面。这种连接模式可能与 BLA 在觅食和估价中的作用有关，这被认为需要与腹侧额叶区域相互作用。

总之，针对内侧额叶皮层的单个 BLA 神经元似乎被分成不同的背腹网络；那些针对更腹侧的 scACC 的信号主要局限于该区域，并且主要将分支发送到后腹侧额叶皮层的 NAcc 和 AI。鉴于 scACC 和杏仁核在调节一般情感和特别情绪方面的已知作用，这些分支投射可能在控制情感状态中发挥作用。相比之下，投射到更多背侧 dACC 的 BLA 神经元也支配腹侧额叶皮层的部分，这些部分是是基于价值的决策的核心，表明该网络对于适应性觅食可能至关重要。

5. 腹侧额叶皮质

作者进行了类似的分析，仅关注投射到额叶皮层腹侧表面区域的 627 个 BLA 神经元，包括 AI、mOFC、lOFC 和 vlPFC（Figure 4A）。在投射到腹侧额叶皮层的 BLA 神经元中，几乎三分之二 (65%) 的 BLA 神经元仅针对 AI。相比之下，只有 10% 单独靶向 vlPFC，这意味着投射到 vlPFC 的大多数 BLA 神经元也靶向腹侧额叶皮层的其他部分。在腹侧额叶皮层内，这些区域分别获得最高和最低比例的特定投射（Figure 4B）。投射到 mOFC 和 lOFC 的 BLA 神经元在那些专门投射到这些区域或分支到腹侧额叶皮层其他部分的神经元之间均匀分布。总体而言，在 BLA 对腹侧额叶皮层的投射中，对 AI 的投射比对更前部区域的投射更特异，其中 vlPFC 从 BLA 接收的特定投射最少。

(A)示意图显示此处分析的四个腹侧额叶皮层投射神经元群：靶向 AI（黄色）、mOFC（蓝色）、lOFC（红色）和 vlPFC（绿色）的 BLA 神经元。A 和 P 分别表示前向和后向； M 和 L 指的是内侧和外侧。
(B)维恩图，说明对每个区域的投射也分支到其他三个区域；AI 投射神经元最不可能分支到其他区域，而 vlPFC 投射神经元最有可能在腹侧额叶皮质层分支。
(C)腹侧额叶皮层投射神经元投射到非腹侧额叶皮层目标的可能性。群体不重叠，因此排除了在 mOFC、lOFC、vlPFC 和 AI 之间分支的神经元。

与内侧额叶皮层类似，投射到腹侧额叶皮层的 BLA 神经元更有可能发送分支，而不是特定的投射。AI-、lOFC-、vlPFC- 投射神经元最有可能投射到两个区域（Figure S7D），而 mOFC- 投射神经元倾向于支配一个或四个区域。AI- 和 vlPFC- 投射神经元最不可能分支到四个不同的区域，表明这两个区域从 BLA 接收更特异的输入。

当作者将分析限制在仅投射到四个腹侧额叶区域之一而不在它们之间分支的 BLA 神经元时，与腹侧额叶皮层的其他区域相比，投射到 AI 的 BLA 神经元对 NAcc 表现出最强的投射（Figures 4C and S7C）。相比之下，与 mOFC 和 AI 相比，vlPFC 和 lOFC 投射神经元最有可能投射到内嗅皮层。有点出乎意料的是，投射到 mOFC 的 BLA 神经元更有可能投射到背侧前运动皮层以及额叶的其他更内侧区域，例如 pgACC。

这些投射模式表明，靶向腹侧额叶皮层的 BLA 神经元具有可重复的连接模式，并支配来自额叶皮层区域的可分离网络；那些靶向 AI 的 BLA 神经元不太可能投射到其他腹侧额叶区域。当它们确实分支到其他区域时，它们主要支配后额叶的其他区域，例如 scACC 和 NAcc。相比之下，BLA 投射到腹侧额叶皮层的更多前部，尤其是 vlPFC，在腹侧额叶皮层和其他区域（包括 dACC、scACC 和 NAcc）有更多分支。vlPFC 投射的 BLA 神经元连接很广泛，这一发现与 BLA-vlPFC 环路在表示和更新无模型刺激结果关联方面的已知作用密切相关，这些信息可能在其他腹侧额叶区域之间共享，以提供信息奖励引导的选择行为。

总而言之，作者发现的投射模式揭示了 BLA 神经元的存在，这些神经元针对内侧和腹侧额叶皮层的不同部分，表明可分离的多区域 BLA 网络。那些针对后额皮质中的 scACC 和 AI 的 BLA 神经元优先支配 NAcc。相比之下，投射到更前内侧和腹侧额叶区域的 BLA 神经元似乎是更分散的区域网络的一部分。

6. 逆行追踪 BLA 到腹侧额叶皮层的特定和分支投射

接下来，作者试图使用标准逆行病毒追踪来评估 MAPseq 揭示的最独特的 BLA 投射模式。然而，作者注意到，通过将逆转录腺相关病毒 (AAV) 离散注射到用 MAPseq 分析的区域的子区域中，这两种方法是互补的，而不是等效的。对于 MAPseq 实验，从每个目标区域收集了大量样本，以便通过组合跨 A/P 级别的解剖样本来评估逐个区域级别的侧枝。相比之下，逆行追踪可以更具体地了解投射到目标区域特定子区域的神经元的起源。这两种方法协同使用时，对于单个细胞分支到两个区域提供证据以及识别分支可能或多或少常见的特定子区域甚至细胞层至关重要。

在一只长尾猕猴中，将编码 mCherry 和 EGFP 荧光团的 retro-AAV2 在 MRI-引导立体定向注射到一个半球的 NAcc (mCherry) 和 AI 外侧亚区域 (EGFP)。注射靶向另一个半球的后外侧 lOFC（EGFP）和后内侧 vlPFC（mCherry）（Figure 5A and 5B）。由于跨半球的 BLA 连接可以忽略不计，能够分别分析两个半球。然后，作者对 BLA 中的神经元进行无偏的体视学计数，这些神经元用每个荧光团进行单标记或双标记。虽然作者在 NAcc 注射部位的腹侧皮质中观察到胞体的密集标记，但注射确实是进入 NAcc，而不是尾内侧无颗粒皮质。这是因为根据之前的工作，如果尾侧皮质的这一部分被注射，预计会在注射的壳核、外侧尾状核和 AI 外侧出现逆行标记，但作者没有观察到。相反，作者发现了腹内侧额叶皮层逆行标记的总体模式，表明先前发表的 NAcc 和内侧纹状体的连接，以及注射部位周围过程的相对分散的标记，正如预期的那样。

(A)左：猕猴大脑的侧面；虚线表示以毫米为单位显示耳内距离的部分。右图：绘制在图谱剖面上的注射目标示意图。
(B)描绘实际注射部位的显微照片：左半球的 AI (EGFP) 和 NAcc (mCherry) 以及右半球的 lOFC (EGFP) 和 vlPFC (mCherry)。每张显微照片下方显示 intra-aural 距离（以 mm 为单位）以及 2 mm 比例尺；图谱和显微照片均按比例绘制。
(C)杏仁核逆行标记示例。左：图谱剖面和 intra-aural 距离（mm）。右上：代表性显微照片（左半球），用逆行标记描绘整个杏仁核；比例尺为 1 mm。右下：较高放大倍数描绘杏仁核副基底核中的双标记细胞；比例尺为 250 μm。
(D)左：AI/NAcc 半球的单标记和双标记细胞的体视学计数。右：基于 MAPseq 结果的相同比较。
(E)与 (D) 相同，但适用于 lOFC/vlPFC 半球。

体视学和 MAPseq 结果的比较发现了大致相似的连接模式，但存在预期的差异。对于投射到 AI 的 BLA 神经元，作者发现体视学和 MAPseq 估计之间分支神经元的比例具有高度的对应性（Figure 5D）。然而，对于 NAcc 投射神经元，MAPseq 和体视学结果不太一致；对特定于单个区域的投射比例的体视学估计高于使用 MAPseq 发现的结果。对于投射到 lOFC 和/或 vlPFC 的 BLA 神经元，专门投射到其中一个区域或分支到两个区域的神经元比例也与在 MAPseq 中发现的不同（Figure 5E）。这主要是因为 BLA 对 vlPFC 的投射的体视学估计几乎与针对 lOFC 的投射完全重叠。因此，这种标准的束追踪方法证实了作者之前的 MAPseq 研究结果，即来自 BLA 的 vlPFC 连接与腹侧额叶皮层的其他部分高度重叠（Figure 4B）。

正如作者之前指出的，逆行追踪和 MAPseq 结果之间专门与分支 BLA 投射的估计差异并不意外。然而，技术之间的这种差异具有启发意义，因为它表明对 area 12 的该子区域的投射甚至比 MAPseq 分析的更大的 vlPFC 连接性具有更少的专门投射。

讨论

作者使用 MAPseq 来表征猕猴 BLA 的单神经元连接。在猕猴身上建立这种方法为非人类灵长类动物单细胞连接的组织研究开辟了新途径。使用这种方法，作者成功确定了 3000 多个单个神经元从 BLA 到额叶皮层、纹状体、部分颞叶和 MD 的投射模式。值得注意的是，此处确定的大量连接模式与之前基于传统束追踪技术的 BLA 投射报告密切一致（Figures 1 and 2）。然后作者发现，单个 BLA 神经元很可能分支并投射到多个区域，其中最有可能分支到四个不同的目标区域（Figure 2）。此外，作者发现单个神经元的投射模式不是随机的，而是具有独特且可重复的连接模式；BLA 对内侧和腹侧额叶皮层后部（包括 AI 和 scACC）的投射具有高度特异性，并且不太可能分支到采样的其他区域。相比之下，对前部或背部区域的投射更有可能分支并投射到额叶皮层的多个其他部分（Figures 3 and 4）。BLA 神经元到额叶皮质的投射模式之间的这种差异可能表明存在可分离的以 BLA 为中心的网络。使用黄金标准束追踪方法进行的其他实验证实了使用 MAPseq 观察到的 BLA 投射模式（Figure 5），显示了结果的有效性。总而言之，作者的研究结果开始揭示单个 BLA 神经元向额叶皮层投射的独特模式，并表明这些投射被组织成不同的网络。

单个杏仁核神经元的专用和分支模式及其与功能的关系

先前的研究表明，BLA 对额叶皮层的投射表现出前后梯度，其中后部区域的投射更密集，而前部区域的投射更弱，作者使用 MAPseq 成功复制了这一发现（Figure 1D）。除此之外，作者报道了在内侧额叶皮质中，投射到前部区域的单个 BLA 神经元最有可能分支并投射到多个区域。例如，投射到 pgACC 的 BLA 神经元表现出最高程度的分支，因为这些神经元也投射到内侧额叶皮层的其他部分（Figure 3B）。相比之下，投射到更靠后的 scACC 的神经元最不可能分支到采样的内侧额叶皮层的其他部分。这种差异意味着靶向 pgACC 的 BLA 信号广泛传播到内侧额叶皮层，而靶向 scACC 的 BLA 信号专门靶向内侧额叶皮层的这一部分。

这里确定的 scACC 和 pgACC 的特定且分离的输入可能为它们在非人类灵长类动物中已确定的情感反应中的相反作用提供神经解剖学基础。从 BLA 到内侧额叶皮层的投射模式的变化也可能有助于解释基于环路的精神疾病治疗方法；靠近的刺激目标可能会对全脑网络和临床症状产生截然不同的影响。具体来说，对 scACC 附近的白质束进行深部脑刺激是治疗难治性抑郁症的一种新兴疗法，但当针对可能涉及 BLA 投射到 scACC 的特定位置时，这种疗法在临床上最为有效，通常由患者特异性纤维束成像确定。

在腹侧额叶皮层中，作者还观察到 BLA 投射的组织存在差异，更多的前部区域接收分支到更多后部区域的投射（Figure 4）。值得注意的例外是腹侧额叶皮层的最外侧部分，vlPFC。该区域收到的投射程度最高，并分支到腹侧额叶皮层的其他区域（Figure 4）。从 BLA 到 vlPFC 的广泛投射可能与该区域在 model-free（而不是 model-based）行为中的作用有关。值得注意的是，vlPFC 的损伤不会影响强化物贬值，而强化物贬值取决于特定的基于感觉模型的信息。相比之下，它们确实会影响概率学习，而概率学习更多地依赖于 model-free 关联，而 model-free 关联依赖于奖励的存在或不存在。因此，作者从单个 BLA 神经元到腹侧额叶皮层确定的特定分支连接模式可能有助于塑造这些区域在认知和行为中的功能作用。

然而，作者注意到，虽然解剖学和功能连接通常紧密结合，在没有直接解剖学连接的情况下也可以存在功能关系，有时通过可能不依赖于直接单细胞投射的振荡耦合来存在。因此，虽然作者推测了使用 MAPseq 在此识别的投射模式的功能意义，但这种推测并不排除 BLA 与发现很少或没有条形码的区域之间存在其他功能相互作用。

解释的局限性

由于这是 MAPseq 首次成功应用于猕猴，因此作者采用了相当粗略的解剖方法，依靠脑沟来区分皮层的各个部分。利用这些大型解剖，作者能够定量评估单神经元分支到多个区域的程度，其规模很大程度上超出了标准解剖技术的范围。然而，作者的神经束追踪结果（Figure 5）表明，特定大脑区域的小子区域的连接模式可能与针对整个研究区域的连接模式略有不同。这凸显了 MAPseq 是一种补充方法，可与传统解剖方法一起使用，以确定单个神经元从一个区域到另一个区域的投射模式。例如，作者通过 MAPseq 结果（Figure 4）和束追踪结果（Figure 5）为包含 BLA、腹侧纹状体和岛叶的充分表征的环路提供额外的单神经元分辨率。

作者还承认，Figure 2 中采用的过度/代表性不足的分析方法依赖于有关控制 BLA 单神经元分支模式的规则的许多假设。由于无法获得用于构建神经元分支概率零分布的定量数据，因此作者不得不依赖于确定的批量投射模式（Figure 1D）。随着更多关于分支程度的数据可用，未来的研究将能够更仔细地描述某些模式比预期更常见或更不常见的程度。同样重要的是要注意，作者构建的这些零模型的比例仅限于本文收集样本的区域。因此，可能无法捕获单个 BLA 神经元的分支投射的全部范围。例如，作者发现在杏仁核之外没有靶标的大部分单个神经元可以投射到本文没有收集样本的颞叶或皮质下区域。确定单个 BLA 神经元如何连接颞叶和皮层下区域将是未来研究的关键途径。

总结和与心理健康的相关性

了解 BLA 投射到额叶皮层的独特特征可能有助于理解许多与杏仁核相关的精神疾病的基础。例如，强迫症与基底神经节-OFC 环路调节估值以及参与动作选择的基底神经节-dACC 环路。在这里，作者确定了一群 dACC 投射的 BLA 神经元，它们也优先针对腹侧额叶皮层的部分，包括 lOFC（Figure 3）。因此，本文的研究结果提供了一个潜在的解剖学基础，通过该基础，单个 BLA 神经元群体的功能障碍可能会影响分布式区域网络。

确定此处确定的不同 BLA 投射模式的不同功能及其分子特征，是下一步的关键，再加上仔细的纤维束追踪研究，以确定感兴趣的子区域，以便比大大脑区域进行更精确的研究在这里评估。此外，最近对人类的研究表明，杏仁核-NAcc 功能连接的差异与心理健康结果高度相关；仔细分析猕猴行为的个体差异，并将其与投射模式联系起来，可以为了解人类这些差异连接性特征的潜在神经基础提供重要的见解。此类工作还有可能将网络层面的理解带入基础神经科学和转化神经科学，并可能为神经网络架构的构建提供更符合生物学现实的基础。

「结束」