infercnv 三回首：深入理解infercnv为何能发nature

大家好，不知你是否还记得，前两次关于infercnv的介绍。请看这里：

肿瘤单细胞转录组拷贝数分析结果解读和应用

单细胞拷贝数变异 infercnv再回首

如果下载了示例数据，并且你已经跑了上述代码，不难得到这张图：

高考作文问你对这张图的理解。

关于我对infercnv的理解：其实结果是哪种图真的不重要，重点是对图形的解读。比如本文中出现的第一张图，里面有个绿色圈圈，可以看到柱子里深灰和浅灰部分（就是我标注的A 和B部分）的突变图景肉眼几乎不可分辨，但是却被分属于两群不同的细胞群。

这就说明：通过肉眼观察，从A和B的突变图景上来看，A和B的突变图景是一致的，那么我们就可以把A亚群细胞与B亚群细胞合并，把他们当作恶性细胞。

但是柱子里所有的深灰和浅灰所对应的组别别是seurat分群里面的2群和4群

这就提示我们本文中的seurat分群结果并不一定能把恶性细胞单纯分出来
（也许我们在seurat里可以把所有分辨率都试一下，理论上应该可以分出恶性细胞）。所以我们要对seurat的分群结果进行重新命名，2群和4群中我画出来的A和B是恶性细胞，但是2群和4群中剩下的其他部分细胞不是。

其实，你仔细去看这张图的话，最左边还有一根柱子，这个柱子不同的颜色对应着infercnv突变图景的聚类结果。你会发现最左边的柱子上存在A1 和B1部分（用红字标出来的部分）正好对应着A1和B1部分的细胞。这里的A1 和B1的聚类结果就是我们想要定义的恶性细胞。我们可以通过代码获取A1和B1部分细胞id（这是一个思考题，如何获取细胞id见文末），进而命名为恶性细胞。

就本数据集而言，通过这样的分析，大家能明白为啥我们要做cnvscore了吗：因为单纯通过seruat分群，只能找出2群和4群为恶性细胞。但实际上只有2群和4群中的A部分和B部分为恶性细胞。 所以说infercnv备受CNS青睐，是因为它精准的预测恶性细胞的能力，而这种能力是普通的降维聚类分群所达不到的(感兴趣的同学可以在seurat中把分辨率调大一点再试试)。

致敬！

Anoop P. Patel, Itay Tirosh, et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma. Science. 2014 Jun 20: 1396-1401

Tirosh I et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq. Science. 2016 Apr 8;352(6282):189-96

Tirosh I et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 2016 Nov 10;539(7628):309-313. PubMed PMID: 27806376; PubMed Central PMCID: PMC5465819.

Venteicher AS, Tirosh I, et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 2017 Mar 31;355(6332).PubMed PMID: 28360267; PubMed Central PMCID: PMC5519096.

Puram SV, Tirosh I, et al. Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer. Cell. 2017 Dec 14;171(7):1611-1624.e24. PubMed PMID: 29198524; PubMed Central PMCID: PMC5878932.

02

ok，我这里只是稍带了一下infercnv的厉害之处，下面我们进入第二个问题，你知道为什么为什么有的文章会使用另外一种图吗？：

大家可以看到最左边的柱子，本文第一个图是多色的，而这个只有靛青色。你知道这分别代表什么意思吗？欢迎来稿，说出你的见解，下期见分晓~。

2.5

有的时候还会出现下面这种图，看着就很诡异：

但是真不用害怕，这些图都是正常的，这是由于参数的原因！你要学会找到你到底需要哪一张图。

出现各种奇怪的图，基本就两个原因：1.参数原因（cluster_by_groups和leiden_resolution参数特别重要） 2.细胞数量原因。详情见官方链接https://www.youtube.com/watch?v=-qOcHAavZT8

下面列举七种不同参数出的不同结果

当然你可以在每个代码里面都加上 denoise=T参数进行降噪处理

接下来就展示一下不同的代码参数，所获得的突变图景，稍有差别。

0

如果没有cluster_by_groups=T参数的话,图形丑且不能用。

  # cutoff=1 works well for Smart-seq2, and cutoff=0.1 works well for 10x Genomics  infercnv_obj2 = infercnv::run(infercnv_obj,                                cutoff=0.1, # cutoff=1 works well for Smart-seq2, and cutoff=0.1 works well for 10x Genomics                                out_dir= "infercnv_output_noclusterbygroup",  # dir is auto-created for storing outputs                               # cluster_by_groups=T ,   # cluster                                hclust_method="ward.D2", plot_steps=F)

后面都加上这个参数：

 # cutoff=1 works well for Smart-seq2, and cutoff=0.1 works well for 10x Genomics  infercnv_obj2 = infercnv::run(infercnv_obj,                                cutoff=0.1, # cutoff=1 works well for Smart-seq2, and cutoff=0.1 works well for 10x Genomics                                out_dir= "infercnv_output",  # dir is auto-created for storing outputs                                cluster_by_groups=T ,   # cluster                                hclust_method="ward.D2", plot_steps=F)

 infercnv_obj2 = infercnv::run(infercnv_obj,                                cutoff=0.1, # cutoff=1 works well for Smart-seq2, and cutoff=0.1 works well for 10x Genomics                                out_dir= "infercnv_output2",  # dir is auto-created for storing outputs                                cluster_by_groups=T ,   # cluster                                leiden_resolution = 0.01,                                hclust_method="ward.D2", plot_steps=F)

infercnv_obj2 = infercnv::run(infercnv_obj,

                                cutoff=0.1, # cutoff=1 works well for Smart-seq2, and cutoff=0.1 works well for 10x Genomics                                out_dir= "infercnv_outputres0.6",  # dir is auto-created for storing outputs                                cluster_by_groups=T ,   # cluster                                leiden_resolution = 0.6,                                hclust_method="ward.D2", plot_steps=F)

  infercnv_obj2 = infercnv::run(infercnv_obj,                                cutoff=0.1, # cutoff=1 works well for Smart-seq2, and cutoff=0.1 works well for 10x Genomics                                out_dir= "infercnv_outputres0.01",  # dir is auto-created for storing outputs                                cluster_by_groups=T ,   # cluster                                leiden_resolution = 0.01,                                HMM = TRUE,                                 plot_steps=F)                                #subcluster

  infercnv_obj2 = infercnv::run(infercnv_obj,                                cutoff=0.1,  # use 1 for smart-seq, 0.1 for 10x-genomics                                out_dir="infercnv_output_mycodes",  # dir is auto-created for storing outputs                                analysis_mode="subclusters", # 更好方法，按照 cnv 亚群进行预测，而不是样本。能更好的区分肿瘤异质性。                                cluster_by_groups=T,  # 根据细胞类型对肿瘤细胞执行单独的聚类，如 cell annotations 文件中定义的那样                                denoise=T,  # 去噪处理                                num_threads=18, # 设置线程数, 多线程运行，加快计算速度                                HMM=T,                              #  hclust_method="ward.D2",                                 plot_steps=F                                )

    infercnv_obj2 = infercnv::run(infercnv_obj,                                cutoff=0.1, # cutoff=1 works well for Smart-seq2, and cutoff=0.1 works well for 10x Genomics                                out_dir= "infercnv_outputres0.1",  # dir is auto-created for storing outputs                                cluster_by_groups=T ,   # cluster                                leiden_resolution = 0.1,                                #hclust_method="HMM",                               plot_steps=F)

 infercnv_obj2 = infercnv::run(infercnv_obj,                                cutoff=0.1, # cutoff=1 works well for Smart-seq2, and cutoff=0.1 works well for 10x Genomics                                out_dir= "infercnv_outputres0.2",  # dir is auto-created for storing outputs                                cluster_by_groups=T ,   # cluster                                leiden_resolution = 0.2,                                HMM = TRUE, plot_steps=F)