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母体在环境化学物质中暴露可能对后代的健康造成不利影响。越来越多的证据支持这些不良效应至少部分受表观遗传修饰调控。目前尚不清楚血液中的表观遗传变化是否反映了大脑皮层或肝脏等目标组织中的类似变化。

2024年6月4日，美国密歇根大学Rachel K Morgan和Kai Wang合作分析了围产期发育期间，与人类相关的铅(Pb)和邻苯二甲酸盐(DEHP)暴露相关的大脑皮层、血液和肝脏中组织和性别特异性DNA甲基化(DNAm)变化。相关研究成果以“Effects of Developmental Lead and Phthalate Exposures on DNA Methylation in Adult Mouse Blood, Brain, and Liver: A Focus on Genomic Imprinting by Tissue and Sex”为题发表在《Environmental Health Perspectives》期刊。

标题：Effects of Developmental Lead and Phthalate Exposures on DNA Methylation in Adult Mouse Blood, Brain, and Liver: A Focus on Genomic Imprinting by Tissue and Sex（围产期发育期间铅和邻苯二甲酸盐暴露对子代小鼠血液、大脑和肝脏 DNA 甲基化的影响：关注组织和性别的基因组印记。）

时间：2024-6-4

期刊：Environmental Health Perspectives

影响因子：IF 10.1 / Q1

技术平台：WGBS等

本研究在雌性小鼠在交配前2周至子代断奶期间，通过饮水或食物分别暴露于人类相关的剂量的铅(32 ppm)或DEHP(5mg/kg/天)。利用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)技术检测5月龄子代的大脑皮层、血液和肝脏中的DNAm变化。

研究结果表明，大脑皮层包含了与Pb(66%)和DEHP(57%)暴露相关的大部分DMRs。在性别间（Pb和DEHP暴露时分别为13和8个DMR）和暴露类型间(雄性和雌性中分别有55个和39个DMRs)，大脑皮层显示出DMRs特征的最大重叠程度。在所有组织中，检测到的DMRs主要出现在与基因表达调控相关的基因组区域(例如CpG岛和海岸、5'UTR、启动子和外显子)。对包含DMRs的基因进行GO分析结果表明，印记基因受Pb和DEHP暴露的影响。其中，Gnas和Grb10在组织、性别和暴露之间都含有DMRs，并且DMRs特征在目标组织和替代组织之间复制。DMRs在Gnas和Grb10的印记调控区域(ICRs)中富集，再次观察到血液和目标组织之间DMRs特征的复制，主要是铅暴露的雄性动物的血液和肝脏中Grb10 ICR的高甲基化。以上研究结果为印记基因可能是寻找目标组织中有毒物质暴露的表观遗传生物标志物的可行候选标靶提供了初步证据。需要进一步研究等位基因和发育阶段特异性效应，以及是否其他印记基因提供了这种关系的更多例子。

研究方法：

动物暴露模式和组织收集：使用野生型非黄体小鼠（nonagouti a/a），将其随机分配到对照组、铅（Pb）处理组或DEHP处理组。通过饮水或食物暴露于人类相关的铅或DEHP剂量，从交配前2周直至子代断奶。在小鼠5月龄时收集血液、肝脏和大脑皮层组织。

DNA提取和全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)：使用商业试剂盒提取基因组DNA，并利用WGBS技术检测DNA甲基化水平的变化。

数据加工、质量控制和DNA甲基化差异分析：使用多种生物信息学工具和流程进行数据处理和分析，包括MethylSig和metilene软件确定差异甲基化区域(DMRs)。

图1：实验流程。F0代雌性小鼠（6-8周龄）通过饮水暴露于32 ppm的铅（Pb）或通过食物暴露于5mg/kg/天的DEHP中，从交配前2周开始，使用同龄的雄性小鼠（8-10周龄）。铅或DEHP或对照组的暴露持续进行，经过妊娠和哺乳期，F1代小鼠（n a=36）从雌鼠中取出，并分别放置在对照水或食物中。在5月龄时，从F1代小鼠的血液、肝脏和大脑皮层组织（n t=108）中提取基因组DNA。DNA用于制备WGBS文库。在原始数据处理之后，calling差异甲基化区域（DMRs）。

结果图形：

（1）围产期母体Pb和DEHP暴露后子代组织中的DMRs

图2：检测到的DMR。

1. DMRs按组织（血液、皮层和肝脏）、性别（F：雌性，M：雄性）和暴露组（Pb、DEHP和对照组）进行分类，甲基化差异>5%，FDR<0.1。

B-E. 在一种以上组织类型中发现的DMRs进一步按性别和暴露进行分类（B）。对性别组（C）和暴露组（D）共有DMR进行定量，并按组织类型细分。DMR方向变化比例通常总结为每种组织-性别-暴露组合，%XX表示DMR高甲基化百分比（E）。

（2）在小鼠基因组区域中检测到DMR的患病率

图3：检测到的DMR的基因组区域。

将DMR比对到小鼠参考基因组（mm10），并将其基因组区域注释为该性别和每个组织内暴露的总DMR的百分比（比较对照和暴露样品）。将这种分布与随机分布中预期的分布进行比较。

（3）与DMR基因相关的GO分析

图4：与Pb暴露组织中含DMR基因相关的GO分析。

Pb暴露组织中的含DMR基因进行三类GO分析：生物过程（GOBP），细胞成分（GOCC）和分子功能（GOMF）。

图5：与DEHP暴露组织中含DMR基因相关的GO分析。

（4）印迹位点的DNA甲基化变化

图6：Gnas和Grb10位点上与Pb和DEHP相关DMRs的基因组定位和方向。

在Gnas和Grb10位点中检测到的DMR根据其在每个基因的基因组位置进行分类。甲基化变化百分比通过大小表示，甲基化变化方向通过颜色表示（圆圈：DEHP样本中高甲基化DMRs；正方形：DEHP样本中的低甲基化；菱形：铅样本中高甲基化区域；三角形：铅样本中的低甲基化）。

（5）印记调控区域中与暴露相关的变化

图7：在Pb和DEHP暴露组织的Gnas和Grb10ICR中检测到的DMR。

1. 在GnasICR、Nespas和Gnas中检测到的DMR。
2. 在Grb10中检测到的DMR。DMR仅表示与ICR的基因组坐标相对应的相关基因组位置。

研究小结：

本研究系统地评估了围产期母体暴露于铅（Pb）或DEHP后，5月龄子代小鼠的大脑皮层、血液和肝脏中的DNA甲基化变化。通过GO通路分析确定基因组印记受Pb和DEHP暴露的影响，并且印记基因Gnas和Grb10在分析全基因组及其ICRs时提供了一致的DNA甲基化变化初步证据，表明它们可能是探索环境暴露表观遗传生物标志物的有用候选者。

以上研究结果表明，印记基因及其印记调控区(ICRs)可能是寻找有毒物质暴露表观遗传生物标志物的可行性候选标靶。为了最大化这一研究目标的效用，未来的工作旨在评估对基因表达的影响，这将扩展对暴露对目标组织（如大脑或肝脏）健康影响的认识。本研究突出了印记基因的潜力，同时需要需要进一步研究等位基因特异性效应、发育阶段的作用，以及这些表观遗传变化对功能健康结果的意义。

关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

• 全基因组甲基化图谱课题
• 标志物筛选课题
• 小规模研究课题

技术优势：

• 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
• 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
• 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G）、染色质结构与功能组学技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900.

参考文献：

Morgan RK, Wang K, Svoboda LK, Rygiel CA, Lalancette C, Cavalcante R, Bartolomei MS, Prasasya R, Neier K, Perera BPU, Jones TR, Colacino JA, Sartor MA, Dolinoy DC. Effects of Developmental Lead and Phthalate Exposures on DNA Methylation in Adult Mouse Blood, Brain, and Liver: A Focus on Genomic Imprinting by Tissue and Sex. Environ Health Perspect. 2024 Jun;132(6):67003. doi: 10.1289/EHP14074. PubMed PMID: 38833407.

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