Integrating single-cell and bulk RNA sequencing data unveils antigen presentation and process-related CAFS and establishes a predictive signature in prostate cancer
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38221616/#full-view-affiliation-3
文章思路学习：基于肿瘤相关成纤维细胞的前列腺癌患者分层研究。个人总结：患者的分层（分型）研究，首先要基于相关基因集进行分层，然后建立量化分型评分模型，最后进行评分模型的预后及免疫治疗分析。关于模型的验证，使用匹配的相关数据（例如转录组+患者免疫组化数据），或者筛选关键基因进行相关的药敏、免疫和功能验证。
该文亮点：使用自有的数据提取出基因集。6例患者在根治性前列腺切除术前3-6个月内未接受任何治疗，其余6例患者在术前接受了阿比特龙和亮丙瑞林的雄激素剥夺治疗。采用SMART技术对从接受不同治疗的患者体内分离出的原发性CAFs的转录组进行测序。对差异表达基因（DEG）进行了筛选，这样就得到了雄激素剥夺治疗（ADT）前后肿瘤CAF细胞的差异基因集。后续作者还基于CAF细胞进行了相关的实验验证。
研究流程
1，患者 CAF 细胞分析（得到基因集）
为了阐明ADT前组和ADT后组之间的差异基因表达谱，进行了转录组测序。根据我们的转录组测序数据，在ADT前和ADT后组之间共鉴定出281个差异表达基因（DEGs），包括134个上调基因和147个下调基因。
通过转录组测序数据分析和功能富集分析，鉴定 ADT 前和 ADT 后治疗之间的 DEG。 DEG的火山图。B 转录组数据热图。GO-BP项（C）、GO-CC项（D）、GO-MF项（E）和KEGG通路DEGs的富集分析（F)
2，单细胞识别APP（抗原呈递） 相关 CAF
从单细胞数据集中对CAF细胞进行聚类分析。从InnateDB数据库（https://www.innatedb.com）中获得了包含431个抗原加工和呈递相关基因（APPRGs）的基因集（表S1）。为了进一步研究参与抗原加工和呈递的CAF，我们采用NMF算法对CAFs中的431个APPRGs进行了降维分析。根据 scRNA 表达基质测定 CAF 中的不同细胞类型。
我们研究中使用的 PCa scRNA-seq 包括来自 13 个前列腺癌患者样本的 36,424 个细胞，注释了上皮细胞、T 细胞、髓样细胞、基质细胞和 B 细胞等主要细胞类型（图3A）。细胞聊天分析揭示了这些细胞类型之间的大量相互作用（图3B）。图3C显示了 13 个前列腺癌样本中六种细胞类型的比例。在 PCa 数据集中，基质细胞被分为 CAFs 和内皮细胞（图3D）。随后，使用 APPRGs 对 CAFs 进行了 NMF 聚类，从而确定了七个亚型（图4A）。接着，伪时间分析显示了 NMF 聚类的 CAF 亚型的轨迹（图4B）。进一步分析七个 NMF 亚型的特征基因，发现了与 APP 相关的 CAF，即 CTSK + MRC2 + CAF-C1。没有表现出 APP 相关效应的 CAF 被命名为 NoneAPP-CAF-C2（图4C）。此外，细胞间通讯分析表明，与非APP-CAF-C2细胞相比，CTSK + MRC2 + CAF-C1细胞表现出与上皮细胞和T细胞更多的配体受体连接（图4D、E）。
使用 t 分布随机邻域嵌入 （t-SNE） 和均匀流形近似和投影 （UMAP） 图对 32,602 个像元进行单元类型注释。B 使用 CellChat 分析六种主要细胞类型之间的细胞\细胞通信。C 患者的细胞组成，显示细胞类型的分布。D 从基质细胞中鉴定 CAF
CAF中抗原加工和呈递相关亚型的鉴定。基于CAF中APP相关基因的NMF聚类亚型的UMAP可视化。B NMF簇的伪时间轨迹分析。C CAF 中 APP 相关亚型的定义。从 APP 相关 CAF 到上皮细胞 （D） 和 T 细胞 （E） 的细胞通讯。F 与 APP 相关的 CAF 亚型与先前签名之间的关联。G 热图显示两种 APP 相关亚型之间常见信号通路基因的平均表达水平差异
3，单细胞RNA测序数据鉴定APPCAF相关基因
根据上一步的分类进行分析。
CTSK + MRC2 + CAF-C1 和 NoneAPP-CAF-C2 亚组的差异基因表达分析显示 55 个显著差异表达的基因，这些基因被命名为 APPCAF 相关基因 （APPCAFRG）（附加文件 3：表 S3）。随后，通过单因素Cox回归分析，鉴定出20个具有BCR预后价值的基因。
这一步补充了部分突变相关的分析。
4，转录组进行聚类分析
接下来，我们使用 20 个 APPCAFRG 的表达谱进行 NMF 共识聚类分析。如图所示。6A和B，我们成功地将TCGA-PRAD队列分为两个簇，并使用cophenetic系数作为评估指标优化分组。随后，我们使用 KM 曲线分析评估了集群之间的预后差异，发现 C1 和 C2 亚型之间的患者预后存在显着差异 （p = 0.011）。此外，C2 簇内的患者表现出 BCR 的中位时间明显缩短（图 1）。6此外，为了进一步研究其显著特征，我们应用了PCA、tSNE和UMAP降维技术，明确证明了C1和C2亚型之间的显著差异（图1）。6D).
5，亚型分析
NMF聚类衍生的不同亚型之间临床特征、肿瘤免疫微环境和基因富集的比较分析。通过NMF聚类识别的亚型中DEG的热图。B 20 个预后相关 APPCAF 相关基因在亚型中的表达模式。C 两种亚型的临床和病理因素比较。D 两个簇之间 23 种免疫细胞类型的差异分析。GO（E）和KEGG通路中两种亚型之间DEGs的富集分析（F)
6，APPCAF相关基因预后特征的建立和验证
为了建立 APPCAF 相关特征，我们最初采用了 Lasso 回归，并使用 20 个 APPCAF 相关基因进行了 10 倍的交叉验证（图 10）。8A，B）。确定了四个关键基因，THBS2、DPT、COL5A1 和 MARCKS，并将其纳入预后模型的开发中。
7，化疗敏感性的预测
8，关键基因验证
参考文献：
Integrating single-cell and bulk RNA sequencing data unveils antigen presentation and process-related CAFS and establishes a predictive signature in prostate cancer
