转录组上游分析-1
作业：
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取出fastq文件中的所有序列ID（第一行）
less SRR1039510_1.fastq.gz | awk '{if(NR%4==1){print $0}}' less SRR1039510_1.fastq.gz | paste - - - - | cut -f 1 -
取出fastq文件中的所有序列（第二行）同上
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对序列出现次数进行统计
less SRR1039510_1.fastq.gz | paste - - - - | cut -f 2 | sort | uniq -c | sort -nk 1如果某一序列出现次数非常高，考虑可能是核糖体RNA？或实验过程中的异常情况，可以比对序列来查看该序列来源
数据质控
数据质量评估
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FastQC软件：可以对fastq格式的原始数据进行质量统计。
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官方网站—帮助文档
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常用参数：
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任务运行
- 在当前窗口直接运行
- 将命令后台运行
nohup ... & - 将命令写入
sh脚本，使用nohup ... &运行脚本
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绝对路径运行脚本
multiqc=/home/t_rna/miniconda3/envs/rna/bin/multiqc fastqc=/home/t_rna/miniconda3/envs/rna/bin/fastqc fq_dir=$HOME/project/Human-16-Asthma-Trans/data/rawdata outdir=$HOME/project/Human-16-Asthma-Trans/data/rawdata # 使用绝对路径运行 $fastqc -t 6 -o $outdir ${fq_dir}/SRR*.fastq.gz >${fq_dir}/qc.log -
确定后台任务结束
- 看结果目录有无正常结果生成
htop中是否有命令正在运行ps fx看本人的进程- 读输出的运行日志
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质控后生成的html文件即质控报告
数据量统计方式：生物学中碱基数量VS计算机中的存储字节（需要加以区分）
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per base sequence quality
按位置展示碱基质量的箱线图
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per sequence quality scores
横坐标：一条序列碱基的平均Q值（一条序列中N越多，质量值越低）
纵坐标：每个质量值对应的read数
较好结果：
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per base sequence content
每个碱基位置上：ATGC含量的分布图
理论上G/C、A/T的含量在测序循环上应分别相等，且稳定呈水平线。
差数据：出现分离。
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per sequence GC content
GC含量分布图，蓝色和红色线分别为理论值和实际值，越接近越好；一般呈单峰分布。
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Atapt
公司提供数据
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整合FastQC结果
multiQC *zip
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数据过滤
原始序列质量控制标准：
- 去除含接头的reads；
- 过滤去除低质量值数据，确保数据质量；
- 去除含有N（无法确定碱基信息）的比例大于5%（可以自定义）的reads。
过滤接头
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trim_galore
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单个样本的运行
trim_galore -q 20 --length 20 --max_n 3 --stringency 3 --fastqc --paired -o ./ ../../rawdata/SRR1039510_1.fastq.gz ../../rawdata/SRR1039510_2.fastq.gz -
多个样本的运行
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先获得样本名组成的文件
ID -
while循环
# 多个样本 vim trim_galore.sh，以下为sh的内容 rawdata=$HOME/project/Human-16-Asthma-Trans/data/rawdata cleandata=$HOME/project/Human-16-Asthma-Trans/data/cleandata/trim_galore cat ID | while read id do trim_galore -q 20 --length 20 --max_n 3 --stringency 3 --fastqc --paired -o ${cleandata} ${rawdata}/${id}_1.fastq.gz ${rawdata}/${id}_2.fastq.gz done
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Tips:
后台任务转前台：
jobs列出任务；fg %1(任务序号)前台任务转后台：
Ctrl+Z暂停，jobs列出任务，bg %1(任务序号)
