项目文章 | 药学TOP期刊PRChIP-seq助力揭示激酶LIMK2促进梗死不良重构的机制

急性心肌梗死（MI）是全球死亡的主要原因，尽管MI的死亡率有所下降，缺血性心力衰竭的发病率却呈上升趋势。这一现象提示我们，尽管在急救和治疗急性心肌梗死方面取得了进展，但心脏在梗死后的长期功能恢复仍然是一个挑战。

2024年8月15日，南京鼓楼医院徐标教授团队、王涟教授团队在Pharmacological Research（IF：9.1）发表了题为“LIM kinase 2 activates cardiac fibroblasts and exacerbates postinfarction left ventricular remodeling via crosstalk between the canonical and non-canonical Wnt pathways”的研究论文。该研究表明，LIMK2通过增强磷酸化β-连环蛋白（Ser552）和Lrp6信号，促进心肌梗死后肌成纤维细胞增殖和不良心脏重塑。这提示LIMK2可能是心肌梗死后损伤治疗的一个靶点。爱基百客为该研究提供ChIP-seq技术支持。

研究路线

研究结果

1. 小鼠心肌梗死后梗死边缘区LIMK核表达增加

LIMKs是细胞骨架动态的关键调节因子，但它们在心肌梗死（MI）中的参与尚未被研究。研究人员通过结扎左前降支冠状动脉评估了小鼠MI模型中LIMK1/2的表达。在小鼠心肌梗死（MI）模型中，LIMK1和LIMK2的表达水平在MI后逐渐增加（图1A-B），免疫荧光染色结果显示LIMK2在梗死边缘区域（BZ）的表达更为丰富（图1C-D），并且这种蛋白在细胞核中的积累在MI后增加（图1E-H）。此外，通过分析公共数据库中的转录组数据GSE183272(n=5)，研究人员还发现RhoA信号通路及其下游的LIMK1和LIMK2在MI后上调，与纤维化相关基因的表达增加相一致，暗示LIMK2可能在MI后的病理重塑中扮演重要角色。

图1.MI后LIMKs表达增加

2. LIMK1/2的缺失减弱了心肌梗死后的病理心脏重构，并抑制了肌成纤维细胞的激活

采用LIMK1/2双敲除（DKO）小鼠制作心肌梗死模型，并在4周后与WT小鼠比较，评估心功能和病理重塑。心脏超声显示，与野生型（WT）小鼠相比，DKO小鼠在心肌梗死后展现出更好的心脏功能，包括提高的射血分数（EF%）和缩短分数（FS%），以及减小的左心室直径（LVIDd）和增厚的左心室壁（图2A-B）。此外，Masson染色发现DKO小鼠的心脏组织中纤维化程度降低（图2C-D），纤维化相关蛋白的表达量减少（图2E-F），且心肌纤维母细胞的激活标志物α-SMA和Periostin的表达也下调。在心肌梗死（MI）后，LIMK2及其磷酸化形式（phospho-LIMK2）与cFbs增殖标志物Ki-67和细胞外基质蛋白periostin的共定位增多（图2G-H），LIMK1及其磷酸化形式与periostin和Ki-67的共定位较少（图2I-J）。DKO MI小鼠产生的持续增殖的cFbs（Ki67+Postn+）少于WT MI组（图2K-L）。这些结果表明，LIMK2可能在心肌梗死后促进cFbs增殖中发挥作用。

图2.LIMKs的缺失减轻了心肌梗死后的病理性心脏重构，抑制了心肌cFbs的活化和增殖

3. 心肌成纤维细胞特异性LIMK2过表达通过增加肌成纤维细胞增殖促进不利的心脏重塑

研究人员利用腺相关病毒（AAV）作为载体，构建了携带LIMK1或LIMK2基因的AAV，以便在心脏成纤维细胞中特异性过表达LIMK1或LIMK2。处理4周后，评估所有小鼠的心功能，然后处死（图3A）。4组小鼠的生存曲线显示，WT+载药组死亡率高于DKO+载药组。与DKO+vehicle组相比，LIMK2OE组的死亡率要高得多，而LIMK1OE组的死亡率差异无统计学意义（图3B）。此外，心肌成纤维细胞LIMK2OE通过左心室增大（LVIDd）、左心室壁变薄（LVAWd、LVPWd）和收缩功能降低（EF%、FS%）显著加重心功能障碍。然而，DKO+vehicle组与DKO+LIMK1OE组之间没有差异（图3C-D）。Masson染色显示，LIMK2过表达显著增加心肌梗死后纤维化长度与心围之比和BZ胶原含量（图3E）。与上述结果一致，DKO+vehicle组和DKO+LIMK1OE组α-SMA和骨膜蛋白水平均低于WT+vehicle组或DKO+LIMK2OE组（图3F）。此外，Postn和Ki-67免疫荧光共染色显示，DKO+LIMK2OE小鼠的增生性成纤维细胞（Postn+Ki-67+）多于DKO+vehicle组。DKO+LIMK1OE与DKO+vehicle组无差异，均维持低水平的成纤维细胞增殖（图3G-L）。综上所述，在心肌梗死后的促纤维化状态和纤维化中发挥重要作用的是LIMK2，而不是LIMK1。

图3.心肌成纤维细胞特异性LIMK2过表达通过促进肌成纤维细胞增殖促进不利的心脏重塑

4. 心肌梗死后，LIMK2依赖于其激酶活性来促进肌成纤维细胞的活化

鉴于LIMK2是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其功能是否依赖于其激酶活性尚不清楚。因此，对K360M突变产生显性LIMK2过表达的AAV进行进一步研究。与活性LIMK2相比，激酶非活性LIMK2（K360M）过表达不影响心肌梗死后DKO心脏增大（图4A）。与DKO+LIMK2OE小鼠相比，LIMK2K360MOE可改善心肌成纤维细胞的心脏收缩功能（EF%和FS%），降低左心室直径（LVIDd），增厚心室壁（LVAWd和LVPWd）。而DKO+vehicle组与DKO+LIMK2K360MOE组间无差异（图4B）。此外，与超声心动图结果一致，生存曲线显示LIMK2K360MOE小鼠的死亡率远低于LIMK2OE组，与DKO+vehicle 组相比无差异（图4C）。与功能性LIMK2相比，LIMK2K360MOE显著限制了过多的I型胶原沉积（图4D）。根据Postn和α-SMA，LIMK2K360MOE在DKO小鼠中的纤维化程度低于LIMK2OE（图4E）。此外，通过比较DKO+LIMK2OE组和DKO+LIMK2K360MOE组之间的Postn+Ki-67+比值，发现K360M突变的LIMK2在心肌梗死后促进肌成纤维细胞活化的功能减弱（图4F-G）。

为了进一步阐明LIMK2在肌成纤维细胞活化中的分子机制，研究者在DKO和野生型小鼠心脏中进行了深度MS-based定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。总蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的热图和PCA图显示，DKO小鼠心脏的主要成分与WT组有显著差异（图4H）。聚类分析结果发现189个和285个显著低磷酸化和高磷酸化蛋白，分别有274个下调位点和428个上调位点（图4I）。此外，26.09%的不同表达蛋白和52.13%的磷酸化差异蛋白位于细胞核内（图4J）。IPA功能表明，这些磷酸化水平改变的蛋白参与了各种病理过程，包括心脏扩张、心功能障碍和心脏纤维化（图4K）。这些发现强调了LIMK2激酶活性在心肌梗死后心脏重塑中的重要性，并为未来治疗策略提供了潜在的分子靶点。

图4.心肌梗死（MI）后，LIMK2依赖激酶活性促进肌成纤维细胞活化

5. LIMK的缺失通过下调β-catenin Ser552位点的磷酸化和抑制β-catenin核易位来减少过度纤维化

根据蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据，研究了假手术小鼠和心肌梗死小鼠心脏核和细胞质组分中的磷酸化β-catenin（Ser552）和总β-catenin的含量。WT组心肌梗死后心肌细胞核磷酸化β-catenin（Ser552）和总β-catenin升高，可通过敲除LIMKs完全阻断。而细胞质中，phospho-β-catenin（Ser552）在WT MI中显著上调，在DKO MI小鼠中保持低水平（图5A）。WT梗死心脏显示β-catenin下游基因转录增加，LIMK1/2的缺失减少了ccnd1，cjun，mmp7的增加，并在转录物和蛋白质水平上保持不变（图5B-D）。免疫荧光染色鉴定了phospho-LIMK2和β-catenin的共定位（白色箭头）（图5E）。与心肌梗死后4周的DKO小鼠相比，WT小鼠的phospho-β-catenin和periostin明显升高（图5F）。这些结果证明，在病理条件下，LIMK缺失可以减少β-catenin易位，两者之间存在共定位。

研究人员使用β-catenin激活剂CHIR-99021处理小鼠，以评估β-catenin激活对LIMK2敲除心脏保护作用的影响。结果显示，CHIR-99021增加了WT小鼠的死亡率和心脏功能障碍，而在DKO小鼠中，这种药物抵消了LIMK2缺失的保护作用，导致心脏功能下降和纤维化增加（图5G-J）。DKO小鼠在MI后心脏纤维化程度降低，而CHIR-99021处理则在一定程度上增加了纤维化（图5K，N）。CHIR-99021增加了WT和DKO梗死心脏细胞核中磷酸化β-catenin（Ser552）和总β-catenin，但对细胞质中磷酸化β-catenin的表达没有影响（图5M，P）。DKO组中，CHIR-99021的Wnt通路下游表达高于对照组（图5L，O）。这些结果表明，LIMK2可能通过调节β-catenin的核易位来促进心肌梗死后的病理性重塑。

图5.促进β-catenin核易位部分降低心肌梗死后LIMKs缺失的心脏保护作用

6. LIMK2结合并上调phospho-β-catenin Ser552的表达，促进TGF-β处理后新生小鼠心室成纤维细胞的活化和增殖

为了进一步探究LIMK2与β-catenin的关系，研究人员将小鼠成纤维细胞（cFbs）分为不同组别并给予TGF-β和CHIR-99021刺激。TGF-β作用后，仅WT cFbs细胞增殖率上调，DKO cFbs细胞增殖率无显著差异。然而，CHIR-99021刺激后，WT和DKO cFbs的增殖均得到促进，这表明β-catenin的核质转运在phospho-LIMK2调节成纤维细胞活化的机制中发挥了作用（图6C-D）。在TGF-β和TGF-β+CHIR-99021的刺激下，LIMK2和β-catenin的核易位都得到了促进。LIMKs的敲除阻断了这一转位，但可以通过CHIR-99021处理来抵消（图6A-B）。WB结果显示，TGF-β或TGF-β+CHIR-99021刺激后，细胞核中的β-catenin和phospho-β-catenin（Ser552）均升高（图6E-F）。在DKO cFbs中，无论是否给予TGF-β，核内的β-catenin和phospho-β-catenin都保持在较低水平。而给予CHIR-99021后，DKO cFbs核中的β-catenin表达上调。在细胞质中，六组间的β-catenin没有显著差异，但phospho-β-catenin在WT cFbs中经过TGF-β或TGF-β+CHIR-99021处理后增加了。β-catenin的下游基因在WT cFbs中经过TGF-β或TGF-β+CHIR-99021处理后增加了。尽管DKO cFbs持续表现出较低的lef、cmy、cjun和mmp7水平，但在CHIR-99021处理后可以逆转这些基因的表达（图6G-H）。

研究发现，在MI后，phospho-LIMK2与phospho-β-catenin（Ser552）在细胞核和细胞质中均增加，且两者在细胞核和细胞质中都存在相互作用，而在假手术小鼠心脏中，两者仅在细胞质中相互作用，表明它们可能在成核过程中具有协同功能（图6I-K）。此外，cFbs模型显示，在TGF-β刺激下，phospho-LIMK2与phospho-β-catenin（Ser552）之间的相互作用增强（图6L-M）。通过ZDOCK分析，发现LIMK2与β-catenin之间存在稳定的蛋白对接模型，其中Arg474与Tyr511之间存在阳离子-π相互作用，Phe341与Tyr511之间存在π堆叠作用（图6N）。这些结果强调了LIMK2在心肌纤维细胞反应中的重要作用，尤其是在TGF-β介导的纤维化过程中。

图6.LIMKs的缺失通过阻断β-catenin的核易位，减轻了TGF-β诱导的新生小鼠心室成纤维细胞的激活

7. 在肌成纤维细胞中，细胞核LIMK2的积累通过结合Lrp6启动子区来促进Wnt信号传导

为了研究LIMK2的功能，研究者生成了NLS缺失-LIMK2过表达（LIMK2ΔNLS OE）的AAV靶向肌成纤维细胞进行进一步研究（其中Postn作为启动子，删除了479-507aa）。与 vehicle AAV组相比，DKO心脏的心脏收缩功能（EF%, FS%）降低，心室壁（LVAWs）变薄。然而，与LIMK2 OE AAV相比，LIMK2ΔNLS OE小鼠有更好的心功能（EF%）和有限的心脏扩张（LVIDd）（图7A）。此外，LIMK2ΔNLS过表达对DKO心肌梗死（MI）小鼠的死亡率没有影响。在DKO+LIMK2ΔNLSOE组中，与DKO+LIMK2OE组和DKO+vehicle组相比，边界区（BZ）的胶原蛋白沉积水平介于两者之间，这与Col3a1、Col1a1、periostin和α-SMA的表达一致（图7B-C）。通过LIMK2、periostin和Ki-67的共染色评估，部分减少了肌成纤维细胞的激活。在DKO+LIMK2ΔNLSOE组中，细胞质LIMK2ΔNLS与periostin和Ki-67的共定位较少（图7D-E）。评估了LIMK2过表达对心肌纤维细胞中磷酸化β-catenin和总β-catenin在细胞核和细胞质中的表达影响，结果表明LIMK2促进了β-catenin的核易位和磷酸化水平的增加（图7F-I）。通过ChIP-seq技术发现LIMK2能够结合到Lrp6的启动子区域，从而可能增强Wnt信号通路的内部化（图7J）。LIMK基因的缺失降低了LRP6的表达，这种降低可以通过在成纤维细胞中过表达LIMK2来恢复。但在成纤维细胞特异性LIMK2ΔNLSOE的DKO小鼠心脏中，LRP6的表达没有变化（图7K-L）。上述结果进一步证实了LIMK2可能转移到细胞核中，并促进LRP6的转录，从而增强Wnt信号的内化。