惊！两个样本的简单分组实验登上了园艺学顶级期刊

在真核细胞中，基因组DNA被包装成高度组织化的核蛋白复合体，称为染色质。染色质的基本单元是核小体，它由一个核心组蛋白八聚体（组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个）组成，其周围缠绕着大约146个碱基对的DNA。这些组蛋白被大量的翻译后修饰（PTMs）修饰，通常被称为表观遗传标记，调节染色质结构，从而调节DNA模板化过程，如转录、重组、复制或修复。组蛋白PTMs甚至被认为是一种表观遗传密码，其中每个标记都有自己要传达的信息。研究组蛋白PTMs在全基因组上的占据位点最常见的技术手段是染色质免疫共沉淀结合高通量测序（Chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing，ChIP-seq）。

2024年6月7日，南京农业大学顾婷婷副教授团队在园艺学顶级期刊Horticulture Research上发表题为“Dynamic histone modification signatures coordinate developmental programs in strawberry fruit ripening”的研究论文。研究利用ChIP-seq绘制了7种组蛋白修饰在草莓基因组上的分布图谱，并揭示了组蛋白修饰参与草莓果实成熟过程，组蛋白修饰尤其是乙酰化状态的转变对成熟相关基因的表达至关重要。值得一提的是，本文仅用了2个样本分组。

01 研究路线

02 研究结果

一. 草莓果实中组蛋白修饰沿基因序列的表征

研究对林地草莓‘Ruegen’的未成熟果和成熟果2个样本进行了7种组蛋白修饰（3种活性标记：H3K4me3、H3K9/K14ac和H3K27ac；2种转录延伸标记：H3K36me3和H3K4me1；2种抑制标记：H3K9me2和H3K27me3）的各2个生物学重复ChIP-seq。有趣的是，3种活性组蛋白标记之间高度相关，2种转录延伸标记之间中度相关，而2种抑制标记的相关性较弱。

基因表达通常与组蛋白修饰的组成和水平有关。研究按表达高低水平将表达基因（FPKM > 0）数量近等分为5个组别，结合ChIP-seq数据绘制了组蛋白修饰在基因上的分布元图（图1）。在成熟果实中，3种活性标记都沿表达基因体分布，并在转录起始位点（TSS）下游达到最高水平。同时，表达量越高的基因组，活性组蛋白标记的富集程度也越高。此外，活性组蛋白标记不在沉默基因中富集。这些结果说明，基因表达水平与活性组蛋白标记的富集成正相关。

两个转录延伸标记，H3K36me3在表达基因的整个基因体中保持高水平，且表达量越高的基因组，H3K36me3的富集程度也越高，不在沉默基因中富集。这说明H3K36me3的富集也与基因表达水平正相关。对于H3K4me1，尽管它也沿表达基因的基因体富集并在沉默基因中耗尽，但它与基因表达的关系相对复杂。表达量越高的基因组，基因体区的H3K4me1水平越高，但TSS周围的H3K9me1水平越低，这说明H3K4me1与基因表达不是简单的正相关。沉默标记则表现相反，它们沿活性基因耗尽。H3K27me3在基因体和TSS周围的富集都与基因表达水平负相关，而H3K9me2仅在TSS周围的富集与基因表达水平负相关。

图1. 7种组蛋白修饰沿基因序列的分布模式

二. 草莓果实中基于组蛋白修饰富集鉴定的8种染色质状态与转录状态密切相关

为了表征草莓基因组中的染色质结构，作者运行ChromHMM来分析草莓果实中沿着每条染色体的七个组蛋白标记的组合存在或缺失情况（图2）。设置分类数量13-30供ChromHMM学习，基于输出参数从学习过程中选择了17个分类模型，进一步将这17个染色质模型基于组蛋白标记富集和基因区发生（比如基因注释和顺式调控区）合并成8个区域或转录相关状态。

为了进一步探索所鉴定的染色质状态的特征，研究检查了各种基因元件包括TEs、DHSs（DNaseI敏感位点）的富集，同时结合基因转录和SmallRNA数据，这显示出每个染色体状态的不同特征。状态I-III、IV、V-VI和VII分别与活性基因区、低表达区、富含H3K27me3的兼性异染色质和富含H3K9me2的组成型异染色质相关，状态VIII几乎不富集七种组蛋白标记（图2A-C）。总体而言，在未成熟果和成熟果中，由一个或多个组蛋白标记绘制的片段分别覆盖了基因组的86.1%和87.6%。

研究还使用ChromHMM计算了过渡参数，该参数说明了每个染色质类别中最接近的基因组位置。从一个类别到另一个类别的过滤概率自动捕获了17个类别的位置偏差，例如以类别4-8为特征的广泛转录结构域，以类别11-14为分组的PcG结构域，以及由类别15-16捕获的组成型沉默结构域。过渡参数分析的结果也支持的八态模型。

状态I-IV与转录活跃或沉默基因相关，这引起了作者的注意。状态I鉴定了TSS近侧序列，以H3K9/K14ac、H3K27ac和H3K4me3的显著富集水平为标志，高密度的DHSs表明开放染色质适合转录。TES周围的序列被鉴定为状态II，以高水平的H3K27ac和DHSs以及中等水平的H3K9/K14ac为标志。状态III捕获了与H3K36me3沉积相关的转录延伸的信号。在状态III中，富含TSS近端特征（H3K9/K14ac、H3K27ac和H3K4me3）和延伸标记H3K36me3的第4类更经常位于接近TSS的基因区域。这与从状态I到类别4的适度过渡概率一致。富含延伸标记H3K36me3和H3K4me1的类别5-6优先位于活性基因的中间部分。类别7被区分为另一组基因序列，包含中等水平的延伸标记以及H3K9me2的富集，代表嵌入转录基因中的富含TE的内含子。最后，与沉默或低表达基因体相关的染色质状态被状态IV捕获，以富集H3K4me1而缺乏H3K36me3来区分。在状态IV中，类别9也富含H3K9/K14ac和H3K27ac，而类别10没有。

与浓缩异染色质相关的基因组序列也被8种染色质状态捕获。状态V和VI捕获了PcG相关的兼性异色区，H3K27me3水平显著。具体而言，状态V和状态VI分别以PcG相关的基因间序列和基因序列为特征。PcG基因状态VI包括三类。类别12和14富含H3K4me3和H3K4me1，代表PcG相关基因体前部和后部的染色质特征，而类别13富含活性标记H3K9/K14ac、H3K27ac和H3K4me3，代表PcG相关表达序列的特征。通过状态VII鉴定了富含H3K9me2的组成型异染色质，获得了高水平的TEs和小RNA。此外，状态VII到其他状态的过渡概率很低，表明状态VII不同于其他状态。

总的来说，研究在草莓果实中发现的8种染色质状态揭示了组蛋白修饰模式与各种基因元件和潜在序列的转录状态密切相关。

图2. 林地草莓中基于组蛋白修饰位置的8种染色质状态与转录状态关联紧密

三. 草莓基因组的染色质中心注释

8种染色质状态将每个基因组位置与特定的状态相关联，产生了对二倍体草莓基因组的染色质中心注释。由8种状态定义的染色质域的全基因组核型视图揭示了大规模组织的几个特征。研究在1号和4号染色体着丝粒附近观察到广泛的富含H3K9me2的结构域（具有相对高密度的TE和大块的H3K9me2峰），表明了着丝粒周围的异染区域（图3A）。

为了探索不同区域的基因组特征，研究分析了1号和4号染色体上广泛富集H3K9me2的结构域和沿常染色体臂（eu.arm）的其他区域的基因表达。结果显示，与eu.arm区域相比，H3K9me2富集结构域有更高比例的沉默基因和更低比例的高表达基因（图3B）。同时，H3K9me2富集结构域包含更多的短（<500bp）基因和长（>5000bp）基因（图3C）。eu.arm区域的基因密度差不多是H3K9me2富集结构域的2倍（图3D）。此外，那些富含H3K9me2的结构域具有显著的TE密度（图3E），相对较低水平的活性标记和较少的H3K27me3着色（图3F）。

因此，8种染色质状态模型突出了具有明显H3K9me2富集的大块，表明了着丝粒周围异染色质，强调了染色质景观将基因组组织与基因表达调控相关联的重要性。

图3. 8种染色质状态揭示的染色质组织创建了林地草莓基因组的染色质中心注释

四. 草莓果实成熟过程中成熟相关基因表达水平与相应局部染色质状态转换的相关性

草莓果实成熟伴随着关键基因的转录重编程，作者分析了以前强调的成熟相关基因的染色质环境以便研究它们的动态表达与染色质结构变化的关联。研究涉及的成熟相关基因包括参与ABA稳态、花青素生物合成和运输、细胞壁代谢、糖生物合成和香气形成的基因。一共有25个基因在未成熟果和成熟果之间差异表达，其中23个上调，2个下调。一个基因（Fv4CL）嵌在推定的着丝粒周围组成型异染色质的大块中。在其他24个基因中，14个位于富含H3K27me3的片段中，而其他10个位于缺乏H3K27me3的区域中。

尽管25个成熟相关基因处于不同的染色质环境，其中23个基因的表达变化与基因座位点上的染色质状态改变相关。考虑的区域包括基因体、TSS上游500bp和TES下游200bp。7个上调基因和1个下调基因与活性基因状态（状态I-III）的延伸或收缩相关，但与PcG相关状态（状态V和VI）无关，例如花青素积累的FvCHS（图4A和4B）。14个上调基因和1个下调基因与H3K27me3富集的PcG相关状态（状态V和VI）的转换有关，例如用于细胞壁代谢的FvCEL1和FvWRKY48，用于香气产生的FvFAD1，伴随着H3K27me3的显著缺失（图4A和4B）。注意到一些基因与活性基因状态和PcG状态的转换有关（例如FvPAL、Fv4CL），表明染色质状态的交叉对话。

总的来说，研究数据证明了成熟相关基因的基因表达水平与其局部染色质状态之间的密切联系，这表明组蛋白修饰与果实成熟有关。

图4. 草莓果实成熟过程中成熟相关基因的表达水平与它们的局部染色质状态切换关系密切

五. 组蛋白乙酰化与成熟相关基因的转录重编程正相关

本研究的染色质状态分析揭示成熟相关基因的转录重编程与H3K9/K14ac、H3K27ac和H3K4me3富集的活性状态以及H3K27me3富集的沉默状态的切换有关。因此，研究进一步分析了基因表达和组蛋白标记的差异富集峰之间的关联。从未成熟果到成熟果，一共有2174个差异表达基因（DEGs），包括971个上调基因和1203个下调基因。DEGs和差异乙酰化/甲基化峰的共分析揭示，在上调基因中，50.1%、19.3%、22.4%和3.8%的基因分别与H3K9/K14ac、H3K27ac、H3K4me3和H3K36me3的获得有关，同时10.9%的基因与H3K27me3的丢失有关（图5A和5B）。下调基因中，54.9%、37.2%、47.4%和4.82%的基因分别与H3K9/K14ac、H3K27ac、H3K4me3和H3K36me3的丢失有关，同时8.1%的基因与H3K27me3的获得有关（图5A和5B）。这些结果表明，成熟过程中的基因表达重编程与组蛋白乙酰化密切相关，组蛋白乙酰化在草莓成熟中起重要作用。

组蛋白乙酰化代表了转录器可接近的开放染色质环境。与此一致，上述对DEGs的分析说明基因表达与H3K9/K14ac水平的密切联系。GO富集显示这些差异H3K9/K14ac峰关联DEGs富集了多种途径，包括光合作用、木质素生物合成和叶绿素生物合成。此外，25个成熟相关DEGs中的22个基因的表达水平与差异乙酰化峰关联且与H3K9/K14ac水平正相关。转录组和RT-qPCR数据均显示ABA分解代谢基因FvCYP707A4a的表达水平下调了71.9%，这与H3K9/K14ac水平的显著降低相对应（图5D、G和H）。类似地，花色苷生物合成基因FvCHS的表达上调超过两倍，这种变化与沿着基因座的H3K9/K14ac水平的显著增加相关（图5E、G和I）。此外，FvCEL1（一种参与细胞壁代谢的基因）的表达上调超过两倍，与H3K9/K14ac富集增加超过两倍平行（图5F、G和J）。

这些结果表明，局部H3K9/K14ac富集水平与成熟相关基因的表达水平呈正相关，组蛋白乙酰化是草莓果实成熟所必需的表观遗传标记。

图5. 组蛋白乙酰化水平与成熟相关基因的表达水平正相关

03 结论

表观基因组修饰在生长和发育过程中介导基因和环境之间的相互作用。这项工作为非跃变水果作物提供了基于组蛋白修饰的染色质注释。研究绘制的二倍体草莓基因的染色质分布图揭示了活跃转录的染色质组织与局部染色质包装密切相关。研究认为，草莓中常染色质和异染色质包装模式表现出极大的复杂性和可塑性，这可能为育种和机理研究提供染色质景观基础。

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