发表时间：2023-04            

发表期刊：Nature Plants

影响因子：17.352             

DOI：10.1038/s41477-023-01387-z

研究背景

根瘤菌是亲和互作寄主植物，感染宿主并在根部形成共生器官根瘤，具有固氮功能，可将大气中的氮转化为有机氨供宿主利用。目前，根瘤中不同类型细胞的具体贡献以及它们在成熟过程中的动态特征仍不明确。由于受限于细胞大小和结构的影响,难以获得原生质体成为限制植物单细胞转录研究的一大因素。凌恩生物特别推出前沿植物组学研究技术--植物单细胞核转录组测序--突破植物单细胞研究壁垒,助力植物科学家破解植物的单细胞表达异质性。

实验设计思路

文章收集大豆（Glycine max L. cv Williams 82）被根瘤菌浸染后第12天和21天时的根瘤组织，以及21天根瘤形成时的根相应区域样本，通过scRNA-seq、snRNA-seq、Stereo-seq、RNA原位杂交等技术对大豆根瘤成熟过程中特异型细胞的动态基因表达进行了全面研究，构建了大豆根瘤的细胞图谱，并确定了稀有细胞亚型及其对根瘤成熟和功能的重要作用。

实验设计概述示意图

研究结果

1. 大豆根瘤和根的单细胞核转录组图谱

通过snRNA-seq技术分析不同发育阶段的根瘤以及21天根瘤形成时的根相应区域，共获得26,712个高质量单核转录组，包括39,337个基因，每个核的基因中位数为1,342，每个核的中位数唯一分子标识符（UMIs）为1,636。通过scVI对3个数据集进行整合后，识别出15种不同细胞簇以及每个簇的上调基因，并鉴定了各样本之间每个簇的差异表达基因（图1b、c）。

Stereo-seq研究了相同发育阶段大豆根瘤基因的空间表达，验证了snRNA-seq检测到的细胞簇身份，并根据空间分布情况进行进一步区分：cluster 0-cluster 11（图1c、d），同时RNA原位杂交验证了细胞注释结果（图1e）。

图1 单核和空间转录组联合揭示不同发育阶段的根瘤细胞异质性

2. 根瘤中央浸染区的不同细胞亚型

大豆根瘤中央侵染区（CIZ）共分布有4种细胞簇（图1d），文章基于大豆根瘤的单核数据集，研究了根瘤中未浸染细胞（uninfected cells，UCs）和浸染细胞（infected cells，ICs）的大豆同源基因表达模式，确定了cluster 0、cluster 7、cluster 11为UCs，cluster 12为ICs（图2a）。在UCs中，cluster 0存在于两个不同发育阶段，而cluster 7和cluster 11存在于根瘤成熟的后期（图2b）。文章通过三种主流的轨迹推断算法对所有UC clusters进行拟时序分析，发现分化方向是从cluster 0到luster 7和cluster 11（图2c），表明cluster 7和cluster 11是由cluster 0在根瘤成熟过程中分化来的。

图2 大豆根瘤中央浸染区中的不同细胞亚型

酰脲是大豆等植物根瘤中固氮的主要输出形式，主要在 UCs中合成，相关生物合成的酶在UCs中具有更高的比活性。文章发现，酰脲的生物合成中，根瘤表达的尿酸酶和天冬氨酸氨基转移酶基因在所有UC clusters中均有表达，在cluster 7中上调（图2d），并且多糖分解代谢与淀粉分解代谢相关的通路也被激活，表明cluster 11参与了共生固氮的能量供应。

3. 根瘤浸染细胞的不同亚型及其作用

文章重点关注了根瘤的侵染细胞（ICs），即共生固氮的核心位点（core sites）。所有豆血红蛋白基因和一些结瘤素蛋白基因在cluster 12中高度表达，同时发现ICs中大豆和根瘤菌之间存在活性碳和氮交换。通过重新聚类ICs，发现它们可以进一步分为两种亚细胞类型：c12-0和c12-1（图3a）。其中c12-0亚群存在于两个不同发育阶段的根瘤中，而c12-1小亚群几乎只出现在12天的未成熟根瘤中（图3b）。

文章进一步使用原位杂交，对这两种细胞亚型的特异性基因的表达模式进行验证，证实c12-0和c12-1亚群是两种不同的细胞类型（图3c）。在UCs中，编码共生体膜蛋白的基因在c12-0亚群的表达水平中远高于c12-1和其他亚群（图3d），表明在根瘤感染区c12-0亚群的共生体之间溶质的运动更活跃。

图3 ICs对根瘤的成熟和功能至关重要

对c12-1亚群的特异性表达基因进行分析（图3e-g），结果表明c12-1亚群可能参与了大豆根瘤成熟过程中ICs的转录因子扩增和根瘤菌释放，而这些在细胞中特异性表达的基因（SPK1、NNL1、NPL等）可能在大豆与根瘤菌中相互作用，并在共生建立的最后阶段发挥了关键作用。在CRISPR-Cas9敲除c12-1亚群的特异性表达基因后，发现近50%转基因根瘤的数量增加，感染区呈白色，这为揭示c12-1亚群在根瘤成熟过程中的重要性提供了线索（图3h）。

研究结论

文章通过结合不同发育阶段大豆根瘤的单细胞与空间转录组数据，构建了根瘤的单细胞核转录组图谱，在结瘤的中心感染区，发现未感染的细胞在根瘤发育过程中特化为功能不同的亚群，并揭示了具有丰富的结瘤相关基因感染细胞的过渡亚型，并确定了其在根瘤成熟和功能中的重要作用。总之，本研究获取的实验数据为在单细胞分辨率下进一步研究根瘤成熟的调控网络提供了新见解。

参考文献

Liu Z J, et al. Integrated single-nucleus and spatial transcriptomics captures transitional states in soybean nodule maturation[J]. Nature Plants, 2023.

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