Funakoshi LipiDye II是一款适用于长时间活细胞成像以观察动态脂滴（LDS）合成、移动或降解的绿色荧光染料；是LipiDye（货号：FDV-0010）的升级版，同时具备超强的光稳定性和高灵敏度等特点。
➧ 产品信息
| 货号 | FVD-0027 |
| 规格 | 0.1mg |
| 化学式 | C26H17NO2S2 |
| 分子大小 | 439.5 g/mol |
| 溶解性 | 溶于DMSO |
| 荧光特性 | Ex. 400-500 nm（maximum ~420 nm） 与蓝色激发激光器（如405、445、458、473和488 nm*激光器等）、氙灯或带有商用FITC或GFP滤光片的LED兼容； 注：488 nm可激发LipiDye II，但与473 nm激发相比荧光较弱。 如果使用488 nm激光，请根据实验经验优化成像条件，如染料浓度等。 Em. 450-650 nm（取决于溶剂） 如豆油的最大值~510nm，与LD相似。建议在490-550 nm范围内使用。 |
➧ 产品特点
✍ 可检测非脂肪细胞中直径 < 1μm的微小脂滴。
✍ 适用于长时间活细胞成像，具有超强的光稳定性。
✍ 适用脂滴分解与合成。
✍ 适用于脂肪细胞分化过程，时间可长达8天。
✍ 适用于活细胞、固定处理的细胞以及活细胞染色后再固定细胞染色。
✍ 推荐使用浓度为0.1~1 μM，对细胞几乎无毒性。
✍ 可对细胞脂滴进行半定量分析。
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● 脂滴与LipiDye II
脂滴（Lipid droplets，LDs）是一种具有独特的单层磷脂，可储存甘油三酯和甾醇酯等中性脂质的细胞器（图1）。LDs普遍存在于脂肪细胞中，具有储存能量和脂质运输的功能。研究发现，LDs不仅存在于脂肪细胞，还存在肝细胞和神经胶质细胞等其他非脂肪细胞中，明确LDs具有调节代谢以及保护邻近细胞免受脂质毒性的功能。LDs的数量大小以及组成因细胞类型的不同而不同。例如，脂肪细胞中LDs的直径 > 10μm，可通过光学显微镜观察到；而非脂肪细胞中LDs的直径在0.1μm~1μm（图2）。因此，实现可以检测出活细胞中非脂肪细胞的微小LDs的动态运动及功能将是一个重要突破。
传统的LDs荧光染料（如尼罗河红）仅限于检测脂肪细胞或经过量脂质处理的细胞中相对较大的LDs；在活细胞条件下无法实现检测存在于非脂肪细胞的微小LDs。Funakoshi的LipiDye（货号：FDV-0010）可检测1μm大小的LDs，虽然其具备高灵敏度和高选择性，但LipiDye需要405 nm的激发波长，光稳定性不足，不适合用于长期活细胞成像以观察动态LDs的合成、移动或降解。
因此，Funakoshi又推出了LipiDye的升级版—LipiDye II，可被毒性较低的450-480 nm激发，并具有超强的光稳定性；同时适用于长时间活细胞成像，包括短期多时间激发的Z-stack延时成像。
图1 脂滴的结构与组成
图2 脂滴在脂肪细胞和非脂肪细胞的直径大小
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● 活细胞成像的一般步骤
1、在无血清、无酚红的培养基中配制1 μM的LipiDye II；
（注：LipiDye II可与含FBS的培养基兼容，但需优化FBS和LipiDye II的浓度；推荐浓度0.1 μM用~405 nm激发，浓度1μM用~473 nm激发；根据实验经验优化并确定LipiDye II的浓度）
2、去除培养基，用PBS冲洗细胞数次；
3、向细胞中加入含LipiDye II的培养基；
4、37℃孵育30分钟以上（注：根据实验经验优化孵育时间）；
5、使用PBS或培养基清洗细胞并加入新鲜培养基（可选）；
6、观察细胞。
➧ 参考数据
● LipiDye II的光谱
图A：LipiDye II的吸收光谱几乎不受溶剂影响，可观察LipiDye II在400 nm~500 nm的吸收。
图B：LipiDye II在不同溶剂中有不同的发射光谱。如在甲苯和二氯甲烷等低极性溶剂中，它发出的荧光从蓝色到绿色，量子产率高；另一方面，在高极性溶剂（乙腈、二甲基亚砜和水）中，LipiDye II则表现出弱荧光强度和红移荧光。
图C：用LipiDye II对细胞染色，在荧光显微镜下约500 nm处观察细胞中LDs的发射光谱。
● LipiDye II的光稳定性
分别使用 LipiDye II（红）、旧版LipiDye（蓝）和传统LD dye B（灰）对提前固定在4% 甲醛中的3T3-L1脂肪细胞进行染色；然后用共聚焦显微镜（Ex. 473 nm/Em 490-540 nm）反复采集同一区域脂肪细胞的Z-stack成像，观察荧光强度的变化。传统染料B的荧光强度在5次Z-stack成像后，荧光强度显著降低；旧版LipiDye在经过50次Z-stack成像后，其荧光强度则逐渐降低约60%。而LipiDye II 即使经过50次（共500次光照射），其荧光强度几乎没有任何变化。证明LipiDye II非常适用于长时间的延时成像，具有超强的光稳定性。
● LipiDye II的细胞毒性
使用不同浓度的LipiDye II培养3T3-L1脂肪细胞24小时。随后用MTT法评估细胞活力。结果显示LipiDye II < 5μM对脂肪细胞没有细胞毒性，在10 μM以上才观察到细胞毒性。本试剂推荐使用浓度为0.1~1 μM。
● 活细胞和PFA固定细胞染色
使用LipiDye II染色在活细胞状态下的3T3-L1脂肪细胞，进行活细胞成像。然后用4% PFA固定3T3-L1脂肪细胞，再次进行荧光观察（Ex. nm/Em 490-540 nm）。细胞在固定前后的荧光强度几乎没有任何变化，证明LipiDye II可用于活细胞染色，也可用于活细胞成像后的任何免疫细胞化学实验。
LipiDye®染色的活细胞和经PFA固定后的荧光强度的对比
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➧ 应用数据
● LipiDye II在不同细胞中的染色
使用LipiDye II（1μM）分别对3T3-L1、HepG2、COS-7和HeLa细胞染色12小时，随后在荧光显微镜下观察（Ex. 473 nm/Em 490-540 nm；比例尺：20μm）。在HepG2细胞染色前一天，使用棕榈酸（0.33 mM）/油酸（0.66 mM）处理诱导脂滴形成；HeLa细胞中，可清晰观察到约1 μm的微小LDs（比例尺：5μm）。
● 内质网（ER）标记的多色成像
用LipiDye II（1 μM）对表达ER驻留荧光蛋白（mKO1）的COS7细胞染色12小时。然后使用共聚焦显微镜观察COS7细胞（LipiDye II：Ex. 473 nm/Em 490-540 nm；mKO1： Ex. 635 nm/Em 660-710 nm）。在ER的网络结构中可以观察到 < 1 μm的微小LDs。(比例尺：20 μm、5 μm和1 μm)
● LipiDye II在脂肪细胞分化和成熟过程中的长时间染色
使用含LipiDye II（1μM）的培养基诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为3T3-L1成熟脂肪细胞。含LipiDye II的分化培养基培养前脂肪细胞2天后，每隔2天用含LipiDye II的维持培养基，在共聚焦激光显微镜下观察8天。结果证明，LipiDye II可以对活细胞进行长时间处理，观察脂滴的成熟过程。整个分化过程中没有出现对细胞的毒性作用，同时也没有影响细胞的分化。
● 脂肪生成的Z-stack成像
使用含LipiDye II（1μM）的分化培养基培养3T3-L1前脂肪细胞24小时，并进行Z-stack成像。分化约10小时后，通过共聚焦显微镜（Ex. 473 nm/Em 490-540 nm）观察到有微小的LDs生成（650分钟，白色箭头）；同时可观察到各脂滴在相互作用，逐渐变大的动态（1050~1450分钟，黄色箭头）。
● 脂肪分解的Z-stack成像
将3T3-L1脂肪细胞和LipiDye II（1μM）共同孵育，然后用腺苷酸环化酶激活剂（Forskolin，10 μM）和磷酸二酯酶抑制剂IBMX（100 nM）处理细胞来增加脂肪细胞内cAMP的浓度，从而促进三酰甘油的水解。
添加Forskolin和IBMX后，立即使用共聚焦显微镜（Ex. 473 nm/Em 490-540 nm）进行Z-stack成像（持续800分钟，共3000幅图像）。两小时后，观察到许多微小LDs形成(比例尺：5 μm)。
● STED 超分辨率显微成像微小脂滴
用LipiDye II（1μM）对HeLa细胞进行染色。通过激光共聚焦显微镜（Ex. 473 nm/Em 490-540 nm）和STED超高分辨率显微镜（Ex.473 nm/ Em 500-640 nm、STED 660 nm）观察微小脂滴。STED 成像可检测到半峰全宽（FWHM）约120 nm的微小脂滴，而共聚焦显微镜无法清晰检测。（关于STED显微镜的观察条件及分析方法，请见参考文献）
● 利用荧光酶标仪对细胞脂滴进行半定量分析
首先将三种细胞株（人肾癌细胞786-O、小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a和中国仓鼠卵巢细胞CHO）分别以1 x 104个细胞/孔的数量接种到96孔板中，并在含有10% FBS的DMEM中培养24小时，再用10~200 μM 油酸处理细胞24小时，以促进脂滴的生长。然后用含有2% FBS/DMEM 的5 μM LipiDye II染色2小时。PBS冲洗细胞两次，用荧光酶标仪测量荧光强度（Ex 420 ±5 nm/Em 503 ±10 nm）。结果显示在这三种细胞中观察到脂滴对油酸具有剂量依赖性。
➧ 参考文献
1. Taki et al.,ACS. Mater. Lett.., 3, 42-49 (2021), Fused Thiophene-S,S,-dioxide-Based Super-Photostable Fluorescent Marker for Lipid Droplets
