病毒被称为地球的“暗物质”，亟待研究。近年来，宏病毒组（富集/不富集）的研究呈爆炸式增长，人们越来越意识到病毒在调节微生态平衡上发挥着重要作用。
对于宏病毒组项目而言，在新病毒的发现、病毒溯源和进化模式以及宿主关联等最为关注，这就要求更精确的病毒种类注释以及宿主鉴定等。
目前，对于环境类（水体、土壤等）样本宏病毒组项目，一般是通过宏基因组denovo组装之后，通过 virsorter2/deepvirfinder等软件对vOTUs进行筛选鉴定，然后再用genomad软件进行vOTUs注释分析。
但是，对于植物、昆虫、动物、人类（植物内生病毒、肠道样本等）等宏病毒组，尤其是RNA病毒类的，直接通过gemond注释到的结果中有很多unclassified，导致数据无法使用；目前很多文章其实都是鉴定到以后blastx/blastn已知病毒，然后构建系统进化树。
图1 肠道病毒组多样性
凌恩基于真核生物，包括植物、昆虫、动物、人类等真核宿主的宏病毒组项目，构建了包含原核、真核宿主来源的已知病毒数据库，开发了全新的病毒数据注释流程，通过blastx/blastn比对已知病毒数据库，鉴定病毒序列，然后构建病毒系统进化树。
凌恩目前更新的病毒数据库，包含了NCBI 3.2M哥已知病毒基因组 & IMG/VR V4数据库，种水平去冗余后包含了34,276种病毒！超大的数据库，病毒注释结果更加精准！详情见（产品升级| 凌恩生物最新的病毒数据库重磅上线！3.2M已知病毒基因组& IMG/VR，王炸产品，全面再升级）
真核宿主-宏病毒组研究案例
2024年山东大学齐鲁医学院发布于《Microbiome》的长角血蜱血液宏病毒组文献，长角血蜱的地理入侵、种群扩展和新出现的疾病威胁日益引起人们的关注，作者对山东省长角血蜱的病毒组进行了宏转录组学调查。2018-2022年在全省14个地市采集长角血蜱成虫样本，对136份长角血蜱进行了宏转录组测序。
图2 长角血蜱遗传进化和生态景观会塑造病毒组多样性[1]
研究首先对去除宿主后的宏转录组数据进行了组装，获得了contigs，然后对所有contigs通过Diamond blastx/blastn比对到NCBI NR/NT数据库，鉴定病毒序列，鉴定出508种RNA病毒，包括48个病毒种，其中22种为首次报道。线粒体序列系统发育分析将蜱分为两个遗传类群，每个类群在地理上聚集，并与海拔、降水和归一化植被指数等生态因素显著相关；③ 这两个分支在病毒多样性上表现出显著差异，且共享约五分之一的病毒物种，这些病毒可能已经进化为“多面手”。重症发热伴血小板减少综合征的病原体大别班达病毒仅在第一分支中检测到，而第二分支特有的一半病毒与宿主水生动物（螃蟹、鱼、虾等）相关。总之，长角血蜱的病毒组多样性是由其内部遗传进化和外部生态景观共同决定，为进一步开展病毒与媒介的互作研究和病毒传播风险提供了新的基础。
图3 长角血蜱病毒组的多样性。A 病毒相对丰度分布热图，包括ssRNA( +), ssRNA( −), dsRNA、ssDNA、dsDNA和未分类的病毒。每个样本的性别用顶部相应的颜色表示。b以RNA病毒RdRp蛋白为基础构建系统发育树。
图4 长角血蜱病毒组与宿主关联化树（动物宿主包括人、螃蟹、鱼、虾、蜻蜓和水蛛等）
此外，发表于《Microbioloy Spectrum》的高原蜥蜴肠道宏病毒组文章中，作者通过病毒宏基因组学分析栖息于青藏高原的两种濒危蜥蜴（红尾沙蜥和西藏沙蜥）的肠道病毒组。首先对宏病毒组数据去宿主进行组装获得contigs，然后通过BLASTx比对NCBI的病毒蛋白序列参考数据库，从而鉴定获得病毒序列。
图5 病毒宏基因组学分析揭示高原蜥蜴肠道病毒组[2]
研究结果表明，两种蜥蜴的病毒群组成相似，均以有尾噬菌体目为主，噬菌体群呈现高度的基因多样性；纳木错湖的红尾沙蜥有独特的肠道病毒群特征，细小病毒科占比最高且病毒种类最多；肠道噬菌体的功能基因和抗生素抗性基因（ARG）可能与蜥蜴的高原适应性有关：多数噬菌体功能基因属于能量代谢类别，大量ARG为多重耐药，其中5个ARG为西藏沙蜥病毒组所独有。
图5 高原蜥蜴肠道病毒科水平分类分析[2]。a病毒多样性热图（宿主来源包括藻类、古菌、细菌、无脊椎动物、植物、原生动物和脊椎动物）；b病毒群落PCoA；c 样本聚类。
参考文献
[1]Virome diversity shaped by genetic evolution and ecological landscape of Haemaphysalis longicornis. Microbiome, 2024.
[2]Gut Virome of the World's Highest-Elevation Lizard Species (Phrynocephalus erythrurus and Phrynocephalus theobaldi) Reveals Versatile Commensal Viruses. Microbioloy Spectrum, 2022.
