组蛋白脱乙酰酶介导的胃癌肿瘤微环境特征及协同免疫治疗（多组学文献学习）

①HDAC转录组多数据NMF一次聚类

②ACRG队列中HDAC单独NMF聚类

③HDS评分在胃癌中的临床特征和基因组特征

④高 HDS 可能提示胃癌的“热”肿瘤状态

⑤HDS是胃癌免疫治疗效果的有力预测指标

⑥单细胞转录组测序揭示了高HDS和低HDS患者的TME

⑦内皮细胞和成纤维细胞可抑制T细胞和NK细胞通过MIF信号通路浸润

⑧低 HDS 样品中，CCL17+ 浆细胞样树突状细胞可能通过 MIF 信号通路抑制 T 细胞和 NK 细胞浸润

⑨实验验证机制

一、抑制MIF信号转导可增强肿瘤内T细胞浸润和细胞毒性

二、抑制肿瘤细胞中GPX4的表达可能会激活免疫微环境

三、GPX4敲低可抑制胃癌的肿瘤生长和肝转移

四、GPX4 敲低可能促进 CD8+ T 细胞浸润和细胞毒性

Histone deacetylase-mediated tumor microenvironment characteristics and synergistic immunotherapy in gastric cancer (thno.org)

作者研究背景：

据报道，有18种组蛋白脱乙酰酶（HDAC1-11，SIRT1-7）在染色体结构修饰和基因表达调控中起重要作用。组蛋白乙酰化解离 DNA 和组蛋白八聚体，允许转录因子和协同转录因子特异性结合 DNA 结合位点并激活基因转录。相反，组蛋白的脱乙酰化具有相反的效果。HDAC可逆地调节TME发育过程中组蛋白和非组蛋白的乙酰化状态。此外，HDAC6参与免疫系统中几个关键因子的上调，如PD-1和PD-L1受体，它们是主要的癌症免疫治疗靶点。Brune 等人。发现HDAC抑制剂治疗可以增强Foxp3的表达，从而诱导和维持免疫抑制Treg表型。Kai 等人。研究发现，HDAC3抑制剂可以增强CD8+ T细胞向细胞毒性效应细胞的分化。上述研究表明，HDAC可能是调控TME的重要靶点。然而，不同类型的HDAC在调节TME细胞浸润水平方面存在异质性，单靠单个分子或单一一类分子靶点抑制剂无法精确控制TME的变化。因此，迫切需要系统地分析HDAC表达谱和相应的TME特征，为胃癌的临床治疗策略和预后评估提供理论基础。（也就是从转录组层面研究18种组蛋白脱乙酰酶的共表达模式与胃癌TME之间的关联）

个人总结亮点：①利用转录组数据识别肿瘤亚型；②构建的评分与免疫细胞浸润进行相关性分析识别肿瘤免疫冷热关系；③TIDE与submap还有免疫队列结合分析模型预测免疫性能；肿瘤预测TIDE的使用_tide算法-CSDN博客submap 使用说明-CSDN博客④单细胞及配对转录组数据结合分析不同评分之间的TME差异；⑤实验验证层面不仅验证了MIF信号通路与肿瘤免疫浸润，还根据低HDS评分组的药物分析确定了低HDS敏感的药物，从而挖掘了GPX4 抑制剂。⑥关于实验细胞系的确定，CCLE数据库分析细胞的HDS值，发现AGS细胞的HDS最低，使验证更加充分。基因在各个细胞系表达情况-CSDN博客

①胃癌单细胞和配对转录组揭示胃肿瘤微环境（文献和数据）-CSDN博客

①HDAC转录组多数据NMF一次聚类

首先分析了基因表达与通路和细胞富集之间的相关性，ssGSEA用于通过“GSVA”包评估签名的分数。18 个 HDAC 包括 4 个 I 类 HDAC（HDAC1、HDAC2、HDAC3 和 HDAC8）、6 个 II 类 HDAC（HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9 和 HDAC10）、7 个 III 类 HDAC（SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6 和 SIRT7）和 1 个 IV 类 HDAC（HDAC11）。六个队列（TCGA-STAD、GSE15459、GSE34942、GSE57303、ACRG 和 GSE84437）进行 combat 批次校正然后NMF识别肿瘤亚型，有3个HDAC肿瘤亚型。

（A）细胞中HDACs的机制。（B） HDAC表达与十种癌症相关途径的关联。（C） HDAC mRNA表达水平与免疫细胞浸润之间的相关性。（D） 通过HDACs的mRNA表达确定的三种具有显着预后差异的胃癌亚型。（E）KEGG功能富集分析，了解不同HDAC簇的特征。（F） 不同HDAC簇之间TME细胞浸润水平的差异（CIBERSORT算法）。

②ACRG队列中HDAC单独NMF聚类

单独对ACRG进行聚类分析，然后进行构建评分模型。limma包用于鉴定ACRG队列中不同HDAC簇之间差异表达的基因。FDR值 0.01 被认为表明表达有显著差异。单因素Cox回归分析确定了具有显著预后价值的DEGs。仅保留P值<0.05的基因。最后，采用Boruta算法对具有显著预后价值的DEGs进行降维。HR<为1的基因被定义为基因集A，HR>为1的基因被定义为基因集B。构建评分：

（A） HDAC mRNA在三个HDAC簇中的差异表达。主成分分析揭示了3个HDAC簇的分布情况。不同 HDAC 之间的预后差异。（B）三个HDAC簇中的差异表达基因。热图显示了 103 个基因（A 基因和 B 基因）在 Boruta 算法降维后的表达谱。（C）HDAC特征A基因和B基因的生物学过程。（D）桑基图，显示3个HDAC簇和3个基因簇之间的关系。（E） 不同基因簇之间的预后差异。（F） 通过主成分分析和评估不同HDAC簇和基因簇之间HDS的差异来构建HDS模型。*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001， ****P < 0.0001.

③HDS评分在胃癌中的临床特征和基因组特征

（A） 高 HDS 组和低 HDS 组（TCGA 队列）之间的预后差异。胃癌亚型 HDS 的差异（TCGA 队列）。（B） 高 HDS 组和低 HDS 组（ACRG 队列）之间的预后差异。（C） 胃癌亚型和临床特征（ACRG 队列）中 HDS 的差异。（D-E）采用单因素和多因素COX回归分析HDS和临床特征对总生存期（OS）和无复发生存期的影响。（F） HDS与抗原呈递分子、共刺激分子和共抑制分子之间的相关性。*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001， ****P < 0.0001.

④高 HDS 可能提示胃癌的“热”肿瘤状态

为了研究 HDS 和 TME 之间的关系，我们分析了 TCGA 和 GEO 数据库中的六个胃癌队列。结果显示，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NKT细胞和Th17细胞等免疫细胞的富集评分与HDS呈显著正相关（图4A）。然而，M2巨噬细胞、MDSC、pDCs和基质细胞（成纤维细胞和内皮细胞）等免疫抑制细胞的评分与HDS呈显著负相关。有趣的是，HDS和Treg细胞之间存在显着的正相关关系（图4A）。此外，我们发现HDS与五个胃癌队列中血管生成分子的表达呈显著负相关（图4B）。上述研究表明，高HDS可能表明“热”肿瘤，但与此同时，这些肿瘤表现出免疫抑制。

（A） 在五个胃癌队列中分析了 HDS 和 TME 细胞富集评分之间的相关性。（B） 在5个胃癌队列中，HDS与血管生成分子的表达呈显著负相关。（C） RNA-seq的流程图。（D）生存分析显示，HDS高的患者OS和DFS更长。（E） 在 PKUPH 队列中分析 HDS 和 TME 细胞富集评分之间的相关性。（F） CD8 和 PD-L1 蛋白在高 HDS 和低 HDS 样品中的表达水平。

⑤HDS是胃癌免疫治疗效果的有力预测指标

（A）TIDE算法和submap算法预测高HDS和低HDS肿瘤对PD-1抑制剂的反应。（B） 不同反应组（CR/PR 和 SD/PD）的 HDS 差异（PRJEB40416队列）。（C）ROC曲线揭示了HDS、CPS和HDS+CPS预测免疫治疗疗效的准确性。（D-E）不同反应组（CR/PR 和 SD/PD）的 HDS 差异（PRJEB25780队列）。（F）ROC曲线的AUC值揭示了不同指标预测免疫治疗疗效的准确性。（G） 列线图显示 HDS 结合 MSI 状态和 CPS，以预测胃癌免疫治疗的疗效。

⑥单细胞转录组测序揭示了高HDS和低HDS患者的TME

用单细胞和配对的转录组数据进行分析。

①胃癌单细胞和配对转录组揭示胃肿瘤微环境（文献和数据）-CSDN博客

（A） 分析了 24 个单细胞测序数据集和 20 个配对批量测序数据集。（B）根据标记基因的定义，通过T分布随机邻域嵌入（t-SNE）共鉴定出9个簇。（C） tSNE 图显示了高低 HDS 患者 TME 细胞的特征。 （D） 堆叠图揭示了每个细胞簇中高和低 HDS 的比例。（E） 多次免疫荧光染色验证了高 HDS 和低 HDS 样品中 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞的差异。

⑦内皮细胞和成纤维细胞可抑制T细胞和NK细胞通过MIF信号通路浸润

在低HDS组中，内皮细胞、成纤维细胞和髓样细胞中向CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞的信号通路的数量和强度显著高于高HDS组。

（A）基于CellChat分析了高HDS和低HDS样品中细胞相互作用数量和强度的差异。（B） 圆图和热图显示了高 HDS 和低 HDS 下每个细胞簇相互作用的数量和强度的差异。 （C） tSNE 分析揭示了基质细胞的重聚图。气泡图显示了每个细胞簇的标记基因。（D） 堆叠图显示了每个簇中高HDS和低HDS样品的比例。（E） CellChat用于分析内皮细胞、成纤维细胞、T细胞和NK细胞之间的通讯。（F）气泡图和圆图显示，在低HDS样品中，SFRP2+成纤维细胞、MYH11+成纤维细胞、CD234+内皮细胞和CD69+成纤维细胞可能通过MIF信号频繁与T细胞和NK细胞交流。

⑧低 HDS 样品中，CCL17+ 浆细胞样树突状细胞可能通过 MIF 信号通路抑制 T 细胞和 NK 细胞浸润

（A） tSNE分析揭示了髓样细胞的重新聚类图谱。（B）气泡图显示每个细胞簇中定义的基因的表达。（C）气泡图显示每个细胞簇的标记基因。（D）基于CellChat分析了高HDS和低HDS样品中细胞相互作用数量和强度的差异。（E） 气泡图显示低 HDS 肿瘤中上调的信号通路。（F） 小提琴图显示了 CCL17+ pDC、T 细胞和 NK 细胞中 MIF 信号通路相关配体和受体的表达水平。（G） KEGG展示了CCL17+ pDC的功能。（H） CCL17+ pDCs富集评分与HDS（ACRG队列）之间的相关性。（I） CCL17+ pDCs富集评分对胃癌预后的影响（ACRG队列）。

⑨实验验证机制

一、抑制MIF信号转导可增强肿瘤内T细胞浸润和细胞毒性

A） MIF抑制剂治疗胃癌的方案。（B）MIF抑制剂显著抑制胃癌的生长。（C）免疫荧光显示MIF抑制组和对照组T细胞浸润水平。（D-E）流式细胞术分析MIF抑制剂组和对照组CD8+ T细胞的比例和细胞毒性。（F-G）采用流式细胞术分析MIF抑制剂组和对照组CD4+ T细胞的比例和细胞毒性。*P < 0.05，**P < 0.01。

二、抑制肿瘤细胞中GPX4的表达可能会激活免疫微环境

关于这一步的联系：作者使用CTPR和PRISM数据库被用来识别可能对高HDS和低HDS肿瘤有效的化疗药物（图10A）。发现 HDS 低的胃癌肿瘤可能对 GPX4 抑制剂（ML210、ML162 和 1S3R-RSL-3）、存活素抑制剂（YM-155）和达沙替尼敏感。关于低HDS 细胞系的选择：利用CCLE数据库分析细胞的HDS值，发现AGS细胞的HDS最低，然后进行分析。

（A） CTRP和PRISM数据库预测了低HDS样品的有效化合物。（B） 五种胃癌细胞系的 HDS 值。GPX4 mRNA在不同干预组中的表达。（C） HDACs在高HDS组和低HDS组中的差异表达。（D） 敲低GPX4后HDACs的表达。（E） NC组和GPX4敲低组差异表达基因的GO和KEGG功能富集分析。（F） GPX4敲低后共刺激分子和共抑制分子表达的差异分析。（G） 高HDS组和低HDS组免疫细胞浸润和免疫相关特征的差异分析。*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001， ****P < 0.0001.

三、GPX4敲低可抑制胃癌的肿瘤生长和肝转移

（A） Western blot和qPCR检测验证了GPX4在MFC细胞中的敲低效率。（B）通过细胞凋亡法检测GPX4敲低对细胞凋亡的影响。（C） 通过细胞迁移和侵袭试验检测 GPX4 敲低对细胞迁移和侵袭的影响。（D） EdU 测定法检测 GPX4 敲低对细胞增殖的影响。（英-法）小鼠皮下异种移植模型显示，敲低GPX4可显著抑制肿瘤细胞生长，延长小鼠存活时间。**P < 0.01。

四、GPX4 敲低可能促进 CD8+ T 细胞浸润和细胞毒性

（A）免疫荧光试验显示，GPX4敲低显著促进CD8+T细胞浸润水平。（B）采用流式细胞术分析GPX4敲除后肿瘤组织中CD8+ T细胞的浸润水平。（C）流式细胞术显示，GPX4敲低显著促进CD8+T细胞分泌IFN-γ，增加CD8+T细胞毒性。（D） CD8+ T 细胞的活化并与肿瘤细胞共培养。（E） 通过流式细胞术测定共培养后 CD8+ T 细胞的细胞毒性。（F） GPX4敲低显著抑制PD-L1 mRNA和蛋白的表达。（G）PD-L1 mRNA在小鼠皮下肿瘤中的表达水平。（H） GPX4敲低联合PD-L1抑制剂显著提高免疫治疗疗效，抑制肿瘤生长。

文献：Histone deacetylase-mediated tumor microenvironment characteristics and synergistic immunotherapy in gastric cancer