类风湿性关节炎（RA）是一种自身免疫性关节疾病，其特征是慢性关节滑膜炎、滑膜增生过度和关节损伤。近年来，N6-甲基腺苷（m6A）修饰的RNA在癌症和自身免疫疾病（包括RA）中的调控作用受到广泛关注。2024年3月扬州大学沈维干教授研究团队在杂志Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease Available（IF：6.2）发表了题为“METTL3 knockdown suppresses RA-FLS activation through m6A-YTHDC2-mediated regulation of AMIGO2”研究论文，该研究通过RNA-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、Luciferase报告基因实验（爱基百客均可提供服务）揭示了METTL3通过m6A修饰调控AMIGO2表达，从而影响RA纤维样滑膜细胞（RA-FLS）的增殖和侵袭行为，为类风湿性关节炎的治疗提供了新的潜在靶点。爱基百客为本研究提供了RNA-seq技术支持。
研究背景
RA纤维样滑膜细胞（RA-FLS）在RA的病理生理学中起着关键作用，它们不仅参与滑膜炎性反应，还通过产生病理介质促进软骨损伤和关节破坏。METTL3作为核心的m6A甲基转移酶，在RA-FLS中高表达，并与RA的发病机制密切相关。然而，METTL3介导的m6A修饰在目标mRNA上的作用及其在RA-FLS中的分子机制尚不明确。
研究路线
研究结果
1. METTL3敲减降低了RA-FLS的增殖、迁移和侵袭能力。
最近的研究表明，METTL3在RA患者的巨噬细胞、滑膜组织和RA- fls中表达上调，在RA的发病机制中发挥重要作用。为了表征METTL3在RA-FLS中的作用，研究者首先生成了慢病毒介导的稳定的METTL3沉默的RA-FLS(图1A和B)。功能研究表明，与对照细胞相比，METTL3敲低降低了RA-FLS的活力、增殖、迁移和侵袭(图1C-F)。此外，将METTL3敲除效率最高的RA-FLS用于RA-FLS/软骨植入实验的体内模型，发现与对照组相比，METTL3敲除组的RA-FLS对软骨的侵袭性降低(图1G)。综上研究结果表明，METTL3敲低会抑制RA-FLS的激活。
图1. METTL3敲低会抑制RA-FLS的激活
2. AMIGO2被确定为METTL3的潜在下游靶标
通过对METTL3敲除RA-FLS和对照细胞进行RNA-seq分析和实验，揭示了METTL3缺失如何降低RA-FLS增殖和侵袭行为的潜在机制。RNA-seq分析显示，与对照细胞相比，mettl3沉默的RA-FLS中有322个基因上调，429个基因下调，差异表达至少改变了2倍(图2A)。研究发现METTL3敲除导致AMIGO2 mRNA水平下降，进一步的RT-qPCR和WB实验证实了AMIGO2在METTL3沉默的RA-FLS中表达下调(图2B)。此外，RNA dotblot实验表明，mettl3沉默的RA-FLS中RNA m6A修饰的总体水平降低(图2C)。通过SRAMP数据库预测，发现AMIGO2 mRNA中存在m6A甲基化位点，特别是在5'UTR和CDS区域(图2D)。MeRIP-qPCR检测显示METTL3敲除导致AMIGO2 mRNA的m6A富集减少(图2E)。荧光素酶报告基因实验证实了m6A甲基化对AMIGO2表达的调节作用(图2F,2G,2H)，进一步的RNA稳定性分析表明METTL3敲除加速了AMIGO2 mRNA的降解(图2I)。综合这些结果，研究表明AMIGO2可能是METTL3在RA-FLS中的下游靶点，其表达受m6A甲基化调控。
图2. AMIGO2被确定为METTL3的潜在下游靶点
3. AMIGO2参与了RA-FLS的增殖和侵袭行为
先前有研究报道炎症条件下RA滑膜细胞中AMIGO2上调，并可能在调节细胞存活中发挥作用，但AMIGO2在RA- fls中与m6A修饰相关的生物学作用尚未探讨。为了研究AMIGO2是否调节RA-FLS的增殖和侵袭行为，研究者通过慢病毒介导分别过表达和沉默AMIGO2基因的RA-FLS细胞系（图3A和B）。实际确实观察到在AMIGO2稳定沉默的RA-FLS中，细胞活力和EdU阳性细胞数下降，而在AMIGO2稳定过表达的RA-FLS中，CCK8和EdU检测结果相反(图3C和D)。创口愈合和transwell实验表明，AMIGO2敲低会损害RA-FLS的迁移和侵袭能力，而AMIGO2过表达与对照组相反(图3E和F)。此外，研究者们还使用AMIGO2敲低效率最高的RA-FLS进行RA-FLS/软骨植入实验的体内模型。结果显示，与对照组相比，AMIGO2敲除组RA-FLS对软骨的侵袭性降低(图3G)。研究结果表明AMIGO2参与了RA-FLS的激活。
图3. AMIGO2参与了RA-FLS的增殖和侵袭行为
在METTL3基因稳定沉默的RA-FLS中进行过表达AMIGO2的回补实验，AMIGO2过表达逆转了METTL3敲低诱导的RA-FLS增殖、迁移和侵袭的抑制(图4A-D)。这些结果表明，METTL3缺失可能通过下调AMIGO2的表达来减弱RA-FLS的激活。
图4. AMIGO2过表达部分逆转了METTL3敲低诱导的RA-FLS增殖、迁移和侵袭的减少
4. METTL3缺失通过m6A - YTHDC2介导的机制导致AMIGO2表达降低
YTHDC2之前已被报道在类风湿性关节炎（RA）的炎症调节中发挥作用。为了表征YTHDC2在RA纤维样滑膜细胞（RA-FLS）中的作用，研究者建立了通过慢病毒介导的稳定沉默YTHDC2的RA-FLS（图5A和B）。功能研究显示，与对照细胞相比，YTHDC2敲减的RA-FLS在增殖、迁移和侵袭能力上显著下降（图5C-F）。随后，使用RNA-seq分析比较了对照和YTHDC2敲减RA-FLS之间的转录变化。在YTHDC2敲减的RA-FLS中，共鉴定出114个上调和47个下调的差异表达基因（DEGs），（图6A和B）。为了确认METTL3和YTHDC2共同调节的DEGs，整合了对METTL3沉默和YTHDC2沉默RA-FLS进行的RNA-seq的数据，共鉴定出56个重叠的DEGs（图6C），其中包括AMIGO2。此外，研究证实了在YTHDC2敲减后RA-FLS中AMIGO2表达的降低（图6D）。
图5. YTHDC2敲低可降低RA-FLS的激活
考虑到m6A readers通过识别和结合m6A修饰的mRNA来调节mRNA的代谢和翻译，进行了RIP-qPCR实验，以确定YTHDC2是否与RA-FLS中的AMIGO2 mRNA相互作用。研究结果显示，在对照RA-FLS中，与IgG相比，anti-YTHDC2显著富集了AMIGO2 mRNA，而在METTL3敲减的RA-FLS中，这种富集显著减少（图6E）。为了探索YTHDC2耗竭是否通过下调AMIGO2表达来降低RA-FLS的增殖和运动性，研究者在稳定沉默YTHDC2的RA-FLS中过表达了AMIGO2。结果显示，AMIGO2的过表达部分减弱了YTHDC2敲减对RA-FLS增殖、迁移和侵袭的抑制作用（图6F和G）。此外，在分别用放线菌素D和CHX处理后观察到YTHDC2敲减促进了RA-FLS中AMIGO2 mRNA的降解，而在YTHDC2沉默的RA-FLS中，AMIGO2蛋白稳定性没有显著变化（图6H和I），表明沉默YTHDC2主要通过加速AMIGO2 mRNA的降解来降低AMIGO2的表达，而不是调节其蛋白稳定性。总的来说，研究结果清楚地表明AMIGO2可能是YTHDC2的下游靶标，METTL3敲减可能通过m6A-YTHDC2介导的方式在RA-FLS中下调AMIGO2的表达。
图6.METTL3缺失以m6A - YTHDC2介导的方式降低AMIGO2的表达
04 写在最后
m6A甲基化修饰的异常与多种疾病相关，尤其在癌症中影响肿瘤生长和转移。m6A修饰研究揭示了基因表达调控的新机制，为疾病治疗提供了潜在靶点，成为当前科研的热点领域。我们也总结过《RNA m6A修饰在临床疾病中的研究思路》，如果您有这方面的科研需求，欢迎与我们联系，我们可以为您提供从实验设计、样本处理、数据分析到验证的全流程服务，为您提供全面、专业的技术支持，期待为您的科研工作助力！
