今天给同学们分享一篇生信文章“Polydopamine Nanoparticles Targeting Ferroptosis Mitigate Intervertebral Disc Degeneration Via Reactive Oxygen Species Depletion, Iron Ions Chelation, and GPX4 Ubiquitination Suppression”，这篇文章发表在Adv Sci (Weinh)期刊上，影响因子为15.1。
结果解读：
铁死亡在人类IVDD进展中起作用
GSE56081表达矩阵已经被标准化，箱线图的分布趋势是直线（图1A）。主成分分析（PCA）分析显示了良好的重复性（图1B）。在P值<0.05的阈值筛选下，鉴定出GSE56081数据集中的7859个差异表达基因（DEGs）（4364个上调和3495个下调）。DEGs的火山图如图1C所示。通过进行基因组学百科全书（KEGG）分析，作者确定了参与IVDD的潜在通路（图1D）。功能分析表明，在多个炎症和炎症相关通路（肿瘤坏死因子（TNF）、腺苷5'-单磷酸（AMP）激活蛋白激酶（AMPK）和转化生长因子-β（TGF-β）信号通路）中，泛素介导的蛋白质降解和铁死亡在IVDD进展中起到了作用。因此，作者鉴定出了与铁死亡相关的DEGs。进一步的分析揭示了五个关键基因，包括铜蓝蛋白（CP），铁蛋白重多肽1（FTH1），GPX4，血红素氧合酶1（HOMX1）和TFRC（图1E，F），这五个基因的表达水平在一个环形图中可视化（图1G）。然后，这些基因的交互功能图在支持信息中的图中展示。为了进一步验证铁死亡在IVDD中的参与，还包括了GSE27494，并且KEGG通路富集的结果与GSE56081数据集的分析结果一致。此外，免疫组化（IHC）显示GPX4的蛋白表达水平降低，泛素显著增加在人类IVDD样本中。
PDA纳米颗粒的表征
通过经典的Stöber方法进行了一些修改，制备了PDA纳米颗粒。制备的PDA纳米颗粒是均匀的球形颗粒，具有良好的分散性，这可以从扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）图像（图2A-C）中看出。PDA纳米颗粒的平均流体动力学粒径约为160纳米，尺寸分布较窄，进一步表明纳米颗粒在水中具有良好的分散性（图2D）。PDA纳米颗粒的紫外-可见（UV-vis）吸收光谱显示在400-800纳米范围内有吸收峰（图2E）。通过使用已建立的2,2'-联氨基二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）方法，初步研究了PDA纳米颗粒的抗氧化能力。ABTS可以被ROS氧化为绿色的ABTS+，而在存在抗氧化剂的情况下可以被抑制。评估ABTS+水平代表了样品的Trolox等效抗氧化能力（TEAC），结果显示TEAC值与PDA纳米颗粒的浓度呈正相关（图2F），表明PDA纳米颗粒具有抗氧化活性。抗氧化能力通过使用DMPO（5,5-二甲基-1-吡咯烷-氮氧化物）作为自旋探针，通过电子自旋共振（ESR）进一步验证了PDA NPs的ROS（•OH和O 2 •− ）耗尽能力。如图2G所示，PDA NPs处理后，特征的DMPO/•OH信号呈浓度依赖性下降，说明PDA NPs的•OH清除能力。同样，DMPO/O 2 •− 的特征信号强度在PDA NPs添加后明显下降，而NPs浓度的增加可以进一步降低信号强度（图2H）。这个结果证明了PDA NPs的出色的O 2 •− 清除活性。然后，使用硫酸钛法评估了PDA NPs的H 2 O 2 清除能力。硫酸钛可以与H 2 O 2 反应，光谱法产生过氧化物-钛络合物，存在抗氧化剂时可以抑制其生成。如图2I所示，过氧化物-钛在410 nm处的特征峰随着PDA NPs的加入呈剂量依赖性减少，表明PDA NPs的浓度依赖性H 2 O 2 消耗。随着H 2 O 2 的消耗，与H 2 O 2 共孵育24小时后，PDA的浓度也下降，表明在ROS存在下PDA NPs具有可生物降解性（图2J）。
PDA纳米颗粒清除ROS并螯合Fe，以减轻体外NP细胞的铁死亡作用。
CCK8和细胞毒性测试显示，PDA纳米颗粒的安全浓度在0至1 µg/mL之间，在24至72小时内（IC 50 为3.748 µg/mL）。使用过去描述的t-叔丁基过氧化氢（TBHP）触发NP细胞的铁死亡，作者证实了PDA纳米颗粒（1 µg/mL）通过死/活细胞染色有效且显著地抑制细胞死亡，与TBHP组相比，TBHP+PDA纳米颗粒组的丙碘胺（PI）/卡尔西因比率较低，同时降低了脂质过氧化物（LPO）的产生和铁 2+ 的积累（图3A、B），基于LPO和FerroOrange测定。这随后抑制了TBHP诱导的丙二醛（MDA）产生（图3D）。LPO和FerroOrange的流式细胞术显示了类似的结果（图3E）。基于流式细胞术（图3E）和二氯二氢荧光素乙酸酯（DCFH-DA）探针（图3G、H），底层机制可能涉及PDA纳米颗粒对氧化应激的清除作用。PDA纳米颗粒可以螯合Fe 2+ ，从而抑制TBHP诱导的Fe 2+ ，Fe 3+ 和总Fe的上调（图3F）。最后，PDA纳米颗粒的给药还可以恢复谷胱甘肽（GSH）的产生（图3C），这可能是通过谷胱甘肽过氧化物酶（GPXs）酶调节的。为了抑制纳米颗粒细胞的铁死亡，作者观察到TBHP引起的分解状态在PDA纳米颗粒给药后显著减少（图3I）。考虑到线粒体失调是铁死亡最重要的现象之一，作者通过免疫印迹法监测了氧化呼吸链，并发现PDA纳米颗粒的给药增强了氧化磷酸化（OXPHOS）抗体的功能，并恢复了TBHP诱导的OXPHOS降低（图3J）。
PDA纳米颗粒抑制GPX4的泛素化作用以抑制体外NP细胞的铁死亡
KEGG分析表明，泛素介导的蛋白质降解参与了IVDD（图1D）。因此，作者进一步研究了PDA NPs抑制铁死亡的分子机制，使用不同浓度的PDA NPs（0.25和1 µg mL −1 ）。结果显示，铁蛋白、重链铁蛋白（FHC）和Xct的表达被下调（可能是铁螯合剂的结果），但GPX4和TFR的产量显著上调（图4A、B）。使用TBHP作为铁死亡触发剂，作者观察到PDA NPs通过下调TFR和Xct的蛋白水平，恢复GPX4、铁蛋白和FHC的蛋白水平，从而拯救了铁死亡（图4C、D），与Fth1、Tfrc和Slc7a11的mRNA水平一致。然而，作者没有观察到对GPX4的mRNA和蛋白水平产生类似的影响，这表明GPX4表达可能存在翻译后修饰的可能性。免疫荧光显示，PDA纳米颗粒有效恢复了TBHP下调的GPX4的表达（图4J）。GPX4通过泛素介导的蛋白酶体途径降解；因此，作者构建了Flag标记的GPX4和Myc标记的泛素用于后续的降解实验。使用293T细胞进行转染，作者发现GPX4被多泛素化，而PDA纳米颗粒的给药有效抑制了这种泛素化（图4E）。类似地，PDA纳米颗粒抑制了NP细胞中GPX4的泛素化。为了进一步确认这一发现，作者使用环己酰胺（一种蛋白质合成抑制剂，CHX，50 nm）和MG132（一种蛋白酶体抑制剂，10 µm）来探索GPX4的降解。在CHX组中使用CHX抑制GPX4的合成，在CHX+MG132组中使用MG132抑制泛素介导的蛋白质降解，作者发现GPX4的蛋白水平得到恢复，类似于CHX + PDA纳米颗粒组中的表达水平，表明PDA纳米颗粒能够有效对抗GPX4的降解（图4F,G）。相比之下，在这个过程中，TFR的表达没有改变，而且使用PDA NPs也无法拯救FHC（图4F，G）。使用CHX处理0、4和8小时后，GPX4被降解，但PDA NPs抑制了降解过程（图4H，I）。GPX4的蛋白水平增加，尤其是在MG132处理后的PDA NPs组（图4K，L）。有趣的是，作者发现PDA NPs不仅可以增加Tfrc的mRNA转录，还可以同时抑制TFR的泛素化。
PDA纳米颗粒通过内吞作用被吸收，并在体外与线粒体和GPX4共定位于纳米颗粒细胞中。
接下来，作者构建了荧光异硫氰酸酯（FITC）标记的聚二氨基苯胺（PDA）纳米颗粒，以研究PDA纳米颗粒进入细胞质的机制，并追踪其在纳米颗粒细胞中的分布。通过免疫荧光技术，作者发现FITC-PDA纳米颗粒在细胞质周围分布，并主要与线粒体在纳米颗粒细胞中共定位（图5A、B）。随着FITC-PDA纳米颗粒处理时间从0到24小时的增加，作者发现FITC-PDA纳米颗粒的强度增加，并且与内吞作用标记物Rab5共定位（图5C、D）。此外，通过药物抑制内吞作用，如Pistop2和Hydroxy Dynasore，FITC-PDA纳米颗粒的强度减弱，表明FITC-PDA纳米颗粒通过内吞作用被细胞吸收。在被细胞吸收后，FITC-PDA纳米颗粒聚集在线粒体周围发挥保护功能。使用透射电子显微镜（TEM），作者发现TBHP刺激导致NP细胞线粒体扩张，并模糊了线粒体嵴，这是铁死亡线粒体的典型标志，长度减少，宽度增加 [ 31 ] （图5E）。相反，PDA纳米颗粒对线粒体具有保护作用（图5E），线粒体的平均长度增加，平均宽度减少（图5F，G）。此外，作者使用海马马鞭草测试分析NP细胞的氧耗率（OCR，线粒体呼吸）和细胞外酸化率（ECAR，糖酵解功能）。作者观察到PDA纳米颗粒对TBHP的有害影响产生拮抗作用，并恢复了基础和最大呼吸，但在OCR测试中没有保留呼吸能力。对于ECAR测试，PDA纳米颗粒减轻了增加的糖酵解能力、糖酵解和糖酵解储备。此外，作者观察到FITC-PDA纳米颗粒与GPX4共定位，并抑制其泛素介导的降解，导致其蛋白表达上调（图5H，I）。FITC‐PDA NPs在TBHP处理后的强度保持稳定（图5H，J）。
PDA纳米颗粒减少铁死亡，缓解大鼠IVDD，并在体内靶向GPX4泛素化。
为了进一步验证PDA纳米颗粒的功效，作者按照先前的描述，在大鼠中构建了一个经典的穿刺诱导退化模型。作者根据先前的研究，每周注射一次（图6A），观察到PDA纳米颗粒在48小时后降解了一半，在7至14天之间降解了近90%。此外，两种浓度的PDA纳米颗粒（0.25和1 µg mL −1 ）能够有效减轻椎间盘的退化。主要表现为恢复失去的椎间盘高度和强度（图6B）。作者观察到，穿刺引起的相对椎间盘高度指数（DHI）的降低在PDA纳米颗粒治疗后显著增加（图6C）。通过组织学切片进一步评估组织学变化，作者发现Co7/8的椎间盘受到穿刺的严重退化，表现为髓核组织的丧失、椎间盘纤维化，甚至对生长板的软骨破坏（图6D）。PDA纳米颗粒的给药降低了组织学评分（用于评估退化程度；评分越高，退化越严重）（图6D、E）。此外，Safranin O-Fast Green（SO/FG）染色试验显示，PDA纳米颗粒抑制了纤维化形成（FG染色）和核心脱水物组织的丧失（SO染色），表现为IVD区域SO/FG染色比例的恢复（图6D、F）。免疫组织化学显示，穿刺后GPX4的表达减少，但PDA纳米颗粒的给药恢复了其表达，并且相对集成光密度（IOD）水平显著增加（图6G、H）。此外，使用免疫荧光双标记GPX4和泛素在盘片中，作者发现泛素的强度增加，GPX4的表达减少在穿刺诱导的退化组中（图6I、J），进一步导致铁死亡和盘片退化。然而，PDA纳米颗粒减少了泛素的表达，并恢复了盘片区域GPX4的强度（图6I、J），从而抑制了铁死亡并减轻了IVD的退化。为了进一步确认这个结果，作者从大鼠尾椎间盘中分离出蛋白质，并通过共免疫沉淀评估了GPX4的泛素化情况。作者观察到，在穿刺组中，GPX4水平下降，而泛素增加，但在经过PDA纳米颗粒处理的组（0.25和1 µg mL −1 ）中，GPX4水平恢复，泛素略有下降。因此，PDA纳米颗粒在作者的体内泛素化实验中抑制了GPX4的泛素化。
总结
在这项工作中，PDA NPs给药提出了一种新的治疗椎间盘退变的靶向脱铁症的策略。体外研究表明，PDA-NP通过协同ROS耗竭、Fe2+积累减少，以及更重要的GPX4的泛素化抑制，协助细胞稳态维持，并拮抗氧化应激诱导的NP细胞脱铁性贫血。作者的研究表明，PDA-NP与GPX4相互作用进行翻译后修饰，探索这一机制为蛋白质-材料相互作用提供了新的见解，这将与进一步的研究相关。此外，它提供了一个新的脱铁症靶点，可以减轻椎间盘退变，有可能在未来为临床IVDD治疗做出贡献。
