5+铜死亡+预后模型+分型生信思路，热点搭配免疫相关思路

今天给同学们分享一篇生信文章“The pathogenesis of DLD-mediated cuproptosis induced spinal cord injury and its regulation on immune microenvironment”，这篇文章发表在Front Cell Neurosci期刊上，影响因子为5.3。

结果解读：

基因芯片质量控制

该研究的流程图可在图1中找到。

ASCI中CRGs的表达谱

CRG表达分布和染色体定位分析用于确定ASCI患者中CRG的总体表达情况（图2B，C）。接下来，作者使用Wilcoxon检验确定ASCI组中CRG的表达是否与对照组有所不同。结果表明MTF1，LIPT1，GLS，LIAS和CDKN2A的表达差异显著（图2A）。随后，作者对ASCI患者中的CRG进行差异基因表达分析。作者发现DLD和MTF1在ASCI患者中显著上调，而GLS，LIAS，LIPT1和FDX1在ASCI患者中显著下调（p值<0.05）（图2D）。为确保研究的全面性，作者将Wilcoxon检验和差异基因表达分析的结果进行了合并。

接下来，作者使用Spearman算法分析了CRGs中正负调节因子之间的相关性和相互作用（图3E）。DLD和MTF1之间存在正相关，而DLD、GLS和CDKN2A之间存在负相关（图3A-C）。相关系数大于0.7的基因被认为具有显著相关性，DLD和CDKN2A之间存在显著的负相关（图3D）。

风险模型的构建

为了分析ASCI中CRGs的表达，作者首先进行了单变量逻辑回归分析，以确定与ASCI相关的关键基因。作者采用了LASSO算法来缩小分析范围，并验证与ASCI相关的关键基因（图4B、D、E）。在多变量逻辑回归模型中，将ASCI相关的特征基因纳入，并确定GLS、LIAS和DLD为ASCI的独立风险因素（p值<0.05）（图4B）。根据多变量逻辑回归结果，构建了一个预测性诊断图来预测ASCI的风险（图4A）。校准曲线表明，基于ASCI的独立风险因素的预测性诊断模型能够以极高的准确性识别ASCI患者（图4C）。

临床预测模型的构建

为了辅助临床诊断和治疗，作者将DLD表达水平和临床特征整合到作者的模型中，构建了一个带有分类器的反向传播神经网络架构（图5A）。根据校准曲线，该模型在训练集和验证集中表现出优秀的分类性能（图5B、C）。通过比较预测值和实际ASCI值来评估神经网络的性能，结果显示训练集和验证集的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.8和0.757（图5D、E）。这些结果证实了神经网络临床预测模型在预测ASCI患者的神经功能方面的出色能力。此外，通过使用自定义惩罚函数，作者增强了神经网络模型对小数据集的拟合度，从而防止过拟合的发生。

功能富集分析

与对照组患者相比，作者分析了CRGs对生物相关功能的影响。CRGs的GO功能注释结果显示，生物过程主要由差异表达基因主导，如从丙酮酸合成乙酰辅酶A、乙酰辅酶A代谢过程和乙酰辅酶A生物合成过程（图6A）；分子功能包括抗氧化活性、对供体的醛或酮基作用、以NAD或NADP为受体的酰基转移酶活性和硫转移酶活性（图6B）；细胞组分包括线粒体基质、氧化还原酶复合物和含线粒体蛋白的复合物（图6C）。GO生物过程的前八个富集结果研究了CRGs的调控（图6D、E）。接下来，作者对CRGs在KEGG通路中的富集进行了交互研究，结果表明这些CRGs富集在柠檬酸循环（TCA循环）、丙酮酸代谢和糖酵解/糖新生等通路中（图6F）。

加权基因共表达网络分析（WGCNA）

为了分析ASCI的特征基因集，作者使用GSE151371芯片上的所有基因进行了WGCNA分析。首先，作者对样本进行了层次聚类分析；然后，去除了异常样本，并使用动态剪枝树来识别网络模块（图7D）。在选择最佳软阈值后，验证了无标度网络。结果显示R = 0.87，斜率= -1.97，无标度网络已成功建立（图7A-C）。在排除灰色模块后，作者使用无标度网络模块和外部模块（ASCI）进行了相关性分析，发现象牙色、蓝色、深灰色、马鞍棕色、棕色、深红色、绿色和黑色模块与ASCI之间存在显著关系（p值<0.05）（图7E）。

ASCI组和对照组之间的CRG的PPI网络

作者通过从ASCI和对照组中提取CRG的蛋白质相互作用网络来探索PPI网络的差异。CRG的PPI网络是使用STRING数据库构建的，包含17个相互作用关系和十个CRG，具有0.7的置信指数，0.733的平均局部聚类系数和1.11e-16的富集p值（图8B）。接下来，作者使用Cytoscape软件提取PPI网络的功能相互作用子网络（图8C）。作者还分析了PPI网络节点在四个维度上的中心性：介数中心性、接近中心性、度中心性和压力中心性。结果表明，DLD和LIAS在PPI网络中占据关键位置（图8A）。在对所有CRG、与ASCI相关的WGCNA模块、差异表达的CRG和多元逻辑回归进行共表达分析后，作者发现DLD不仅与ASCI高度相关，而且在ASCI后表达水平发生了显著变化（图8D）。因此，铜死亡调节因子DLD可能在ASCI中发挥重要作用，这是作者下一步分析的重点。

ASCI组和对照组的免疫浸润和相关性

ASCI患者使用CIBERSORT算法评估其免疫特征和免疫细胞浸润水平（图9A）。为了进一步阐明ASCI患者的免疫微环境变化，作者使用ssGSEA估计了免疫细胞浸润的程度（图9B）。在ASCI后，激活的B细胞和激活的CD8 T细胞数量显著减少，而巨噬细胞数量显著增加（p值<0.05）。为了评估免疫浸润分析的稳定性，作者使用了几种免疫浸润算法进行验证，并得出了类似的结论。

为了确定CRGs在ASCI后改变的免疫环境中是否起作用，作者分析了DLD与差异表达的T细胞、B细胞、浆细胞和巨噬细胞之间的相关性。当p值小于0.05时，相关性被认为是显著的。结果表明，DLD与CD8 T细胞呈显著负相关（R = -0.44，p = 5.6e-04）（图10C），DLD与CD4初级T细胞呈显著负相关（R = -0.39，p = 2.8e-0.3）（图10D），DLD与M2巨噬细胞呈显著正相关（R = 0.35，p = 7.9e-03）（图10G）。DLD与其余免疫浸润细胞群体之间没有显著相关性（p值> 0.05）（图10A，B，E，F）。DLD与ASIA分级之间也存在显著正相关（R = 0.37，p = 0.038）（图10H）。作者分析了ASCI高组和ASCI低组患者中的M2巨噬细胞水平，以了解免疫细胞异常在ASCI疾病进展中的作用。结果显示，ASIA高组的巨噬细胞M2含量显著较高（p值< 0.05）。此外，M2巨噬细胞数量和ASIA水平呈显著正相关（R = 0.12，p = 0.046）。这表明外周血巨噬细胞M2在ASCI过程中起着重要作用。

ASCI相关分子亚型的构建和相关性分析

然后，作者根据它们的分子特征构建了ASCI亚型。根据累积分布函数（CDF），最佳方案是有两个亚型，分别命名为Cluster1和Cluster2（图11A-C）。为了验证ASCI分子分型的效果，进行了tSNE分析。结果表明，Cluster1和Cluster2具有出色的分辨率（图11D）。最后，作者计算了ASCI关键基因DLD与两个ASCI分子亚型之间的关联，发现Cluster1（R = 0.25，p = 0.005）和Cluster2（R = 0.46，p = 4.1e-07）与DLD显著正相关（图11E，F）。