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目前，六分之一的夫妇患有不孕不育，其中多达一半的病例由男性因素引起，在过去的40年中，精子数量下降了50%。尽管导致精子质量和数量下降的因素知之甚少，但环境-表观基因组相互作用是可能的。暴露于有毒物质、饮食和 BMI 升高与精子表观基因组变化和男性临床人群的生育能力降低有关。然而，这些研究的重点主要集中在DNA甲基化水平上，而对染色质与精子中DNA甲基化之间相关性知之甚少。父系不良环境暴露与不孕不育和不良结果相关，这种作用可能通过精子的组蛋白修饰传递。到目前为止，对男性精子染色质的深入分析还很有限。

2021年7月20日，加拿大麦吉尔大学Vanessa Dumeaux和Sarah Kimmins团队在《Cell Reports》杂志发表题为“Whole-genome sequencing of H3K4me3 and DNA methylation in human sperm reveals regions of overlap linked to fertility and development”的研究论文，该研究以男性精子样本为对象，通过ChIP-seq和WGBS等技术研究了 H3K4me3 在精子中的位点及其与相同样本中精子 DNA 甲基化谱的关系。

标题：Whole-genome sequencing of H3K4me3 and DNA methylation in human sperm reveals regions of overlap linked to fertility and development（人类精子中H3K4me3和DNA甲基化的全基因组测序揭示了与生育和发育相关的重叠区域）

时间：2021-7-20

期刊：Cell Reports

影响因子：8.8

技术平台：ChIP-seq、WGBS等

研究摘要：

本研究使用深度测序来表征37名男性代表性参考群体中精子的组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)和DNA甲基化图谱。分析结果表明，H3K4me3靶向全基因组和生育和发育相关基因。在原始生殖细胞、胚胎增强子和短穿插核元件(short-interspersed nuclear elements，SINEs)中逃避表观遗传重编程区域也表现出富集。H3K4me3和DNA甲基化在全基因组中存在显著重叠，表明这些标记之间存在潜在的相互作用，而此前报道的这些标记在精子中互斥。精子中H3K4me3标记区域与胚胎转录组的比较分析表明，父本染色质对胚胎基因表达有影响。

研究要点

• 深度测序鉴定人类精子中携带H3K4me3的区域
• H3K4me3广泛分布于基因组中，在启动子和SINE处富集
• 精子H3K4me3标记发育基因并与胚胎基因表达相关
• 除了DNA低甲基化位点外，H3K4me3还与高甲基化区域重叠

研究摘要

研究结果：

1. 组蛋白H3K4me3在精子基因和调控区域富集

图1：H3K4me3在人类精子的CpG区域、启动子区和SINE区富集

从30名男性的精子中制备样本上进行H3K4me3的ChIP-seq，使用MACS2来命名peaks。

1. 基于基因组和CpG注释以及重复元件和低复杂性DNA序列重叠的H3K4me3 peaks位点。从Bioconductor软件包annotatr (Cavalcante and Sartor, 2017)和RepeatMasker (http://www.repeatmasker.org/)中获得注释。不同注释之间peaks重叠通过连接节点来表示，重叠peaks数量显示在它们上方条形图上，显示前10个重叠。
2. 每个特定注释的H3K4me3 peaks富集。通过使用Bioconductor封装区域器(Gel et al.， 2016)确定Z分数来表示阳性和阴性富集。对于所有显示的注释，通过排列测试，p < 0.001。
3. 每次重复注释的H3K4me3 peaks富集；排列检验P < 0.001。

D-E. 箱形图显示精子中启动子不携带H3K4me3的基因表达水平，在位于CpG缺失区域或CpG富集区的启动子上标记了H3K4me3，以及在精子发生(D)和发育©期间启动子与SINEs、低复杂性重复或hESCs增强子重叠。转录水平是基于表达为精原干细胞（SSCs）、精原细胞（有丝分裂期）、精母细胞（减数分裂）和精子细胞（精子发生）中精子发生的TPM转录本丰度或为发育绘制的RPKM片段的千碱基reads来可视化的。P值由成对Wilcoxon秩和检验确定，多重检验采用Benjamini-Hochberg校正。NS表示调整后的p值不显著。*调整后p< 0.05， * * *调整后p < 0.001。

（2）SINE、低复杂性重复序列或胚胎增强子的携带H3K4me3启动子与不同的胚胎过程有关

图2：精子H3K4me3 peaks与CpG富集区、重复元件和hESC增强子之间的重叠

（A-F）基因组浏览器快照显示参考基因组的ChIP-seq轨迹（蓝色）、MACS2 calling的H3K4me3 peaks值（深蓝色框）、CpG岛位点轨迹（红色框，UCSC）、GC百分比热图（蓝色，低GC百分比；白色，50%GC；红色，高GC百分比）、SINE位点（深灰色框）、低复杂性重复序列（深紫色框），LINE位点（紫色框）（从RepeatMasker获得）和hESC增强子的位置（浅蓝色框）。H3K4me3与这些元件中的每一个重叠是RNA介导的基因沉默AGO4（A）的Argonaute基因家族成员，编码微管蛋白亚型TUBA4A和TUBA4B（B）的两个基因，辅助双链断裂修复RAD51（C）的基因，发育基因ID4（D）和SOX11（E），以及最后对于随机基因间区域（F）进行了说明。

（3）H3K4me3 和 DNA 甲基化同时发生在人类精子的功能基因组区域

图3：人类精子中H3K4me3 peaks值区域的DNA甲基化水平

对用于H3K4me3 ChIP-seq的30名男性精子进行WGBS，并评估位于H3K4me3 peak内CpGs的DNA甲基化水平。然后计算peaks标记区域的平均DNA甲基化水平。

1. 具有低DNA甲基化(低甲基化，甲基化≤20%)、中等DNA甲基化(20%≤甲基化≤80%)或高DNA甲基化(高甲基化，甲基化≥80%)的H3K4me3 peaks数。
2. H3K4me3信号(单位:RPKM)中低甲基化(23023个peaks)、中等甲基化(8,087个peaks)或高甲基化(16,777个peaks)H3K4me3 peaks中心（±5kb）的DNA甲基化水平热图(单位:%)。每条线代表一个H3K4me3 peaks。所有peaks的H3K4me3信号和DNA甲基化在热图的顶部总结。

© H3K4me3 peaks内基因组、CpG、RNA和重复序列注释的低甲基化、中等甲基化和高甲基化DNA比例。

图4：人类精子中H3K4me3和DNA甲基化谱

H3K4me3 peaks和DNA甲基化之间的重叠显示在基因组浏览器快照中，显示了HOXA发育基因簇（A）的ChIP-seq轨迹(蓝色)、MACS2 calling的H3K4me3 peaks(深蓝色)、WGBS轨迹(黑色)、CpG岛位点轨迹(红色，UCSC)和GC百分比热图(蓝色，低GC %;白色，50% GC;红色，高GC %)，染色质修饰蛋白ARID5B (B)，精原细胞标记物ZBTB16/PLZF (C)和精子发生基因CYLC2 (C)。H3K4me3 peaks位于非DNA甲基化的CpG岛(黄色)，包括不同甲基化水平区域(紫色)，CpG DNA低甲基化区域(绿色)和中等DNA甲基化区域(灰色)。

（4）精子H3K4me3与DNA甲基化在精子发生和胚胎发生过程中基因调控的功能关系探讨

图5：DNA甲基化水平在精子发生、胚胎发生和基本细胞过程的功能基因启动子区H3K4me3 peaks变化

1. H3K4me3过表达在精子发生相关基因启动子区域具有低、中、高平均DNA甲基化peaks值。与早期精子发生、减数分裂和精子发生相关的基因选自两个数据库：Db1（Jan et al.，2017）和Db2（Wang et al.，2018）。给出了Benjamini-Hochberg校正的超几何最小似然p值。
2. 基因启动子（TSS上游1kb）中的H3K4me3 peaks的GO分析。通过PANTHER过表征测试（GO生物过程完成）检测特定生物过程中的富集度。P值通过Fisher精确检验确定，并对多次检验进行Bonferroni校正。过滤富集度≥1.25的非冗余过程后，显示p值最低的前10个过程。

图6：H3K4me3精子peaks区域的H3K4me3/H3K27me3二价性，存在低、中或高DNA甲基化

H3K4me3和H3K27me3信号(单位：RPKM)在H3K4me3 peaks中心(±5kb)在人类精子(参考30名男性的H3K4me3和已发表的H3K27me3数据(hamoud etal .， 2009))、8细胞人类胚胎和内细胞团(Xia etal .，2019)、 hESC (Grandy etal .， 2015)和人类胎儿器官(Yan etal .，2016) 热图。每个通道代表在参考人群中鉴定的具有DNA低甲基化(23,023)、中甲基化(8,087)、高甲基化(16,777)或未知甲基化(没有CpG或在WGBS中覆盖小于10倍的CpG)的H3K4me3 peaks区域，或者未被H3K4me3标记的H3K27me3精子peaks区域。

（5）精子中的H3K4me3靶向增强子和逃避表观遗传重编程区域

图7：H3K4me3在hESC增强子和逃避重编程区域富集

（A） H3K4me3富集在已鉴定的hESC增强子和超级增强子处达到峰值（Barakat等人，2018），在亚稳态表等位基因区域（Kessler et al.，2018）以及在人类原始生殖细胞（PGCs）中通过DNA甲基化缺失而逃避重编程区域达到峰值（Tang等人，2015）。正富集Bioconductor包regioneR确定的Z评分表示。对于显示的所有区域，通过排列检验，p＜0.001。

（B） 与感兴趣区域相交或不相交的低甲基化、中等甲基化和高甲基化H3K4me3 peaks比例。不相交于感兴趣区域的peaks和相交的peaks比例变化通过χ2检验进行检验，星号表示p<0.001。

本研究的局限性

本研究遵循ENCODE指南，使用DNA甲基化分析的金标准——WGBS，和H3K4me3的深度ChIP-seq分析了加拿大男性代表群体的精子表观基因组。ChIP-seq在7名男性个体中进行验证，WGBS通过定制精子MCC-seq方法进行验证。这种方法的局限性是MCC-seq不能覆盖全基因组。但本研究捕获中覆盖区域验证了WGBS的区域。当然有可能忽略到某些区域的H3K4me3和DNA甲基化存在很强的个体变异性。在未来的研究中，尽管组蛋白保留水平低，但一旦染色质的单细胞分析足够敏感，可以分析精子，就可以解决精子与精子之间的异质性。

关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

• 全基因组甲基化图谱课题
• 标志物筛选课题
• 小规模研究课题

技术优势：

• 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
• 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
• 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，详询易基因：0755-28317900。

参考文献：

Lu Y, Zhou J, Li F, Cao H, Zhang X, Yu D, He Z, Ji H, Lv K, Wu G, Yu M. The Integration of Genome-Wide DNA Methylation and Transcriptomics Identifies the Potential Genes That Regulate the Development of Skeletal Muscles in Ducks. Int J Mol Sci. 2023 Oct 23;24(20) pii: ijms242015476.

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