在临床病理诊断中， 免疫组织化学( Immunohistochemistry, IHC) 是一种很重要的技术和手段。
免疫组化标记时细胞阳性着色程度取决于抗原含量、分布密度和标记方法及其敏感性。
一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为：蓝色，阴性；淡黄色，弱阳性；棕黄色，中等阳性；深棕色，强阳性。
免疫组化原理图
免疫组化分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和染色强度评分法。前者是在光学显微镜下，随机多个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在下按染色强度和染色阳性范围评分，最终分数相加。
但组织样品的病理学分析仍然是耗时且主观的程序，其中人工判断染色强度来评分，直接受到视觉偏差的影响[1]。且阳性细胞计数往往不能自动化进行，导致免疫组化分析费时费力。
这篇文章会怎么利用ImageJ进行免疫组化分析，进行全面的讲解，包括两部分：
1、利用IHC Profiler插件对样本的染色情况进行自动化评分；
2、利用Trainable Weka Segmentation插件分别对阳性细胞和阴性细胞进行计数；
一、IHC Profiler-自动分析染色情况
IHC Profiler，将阳性细胞的平均灰度值（染色强度）和阳性面积百分比（染色面积）共同作为 IHC 测量指标[2]，最终给出四种评分：High positive (3+), Positive (2+), Low Positive (1+) and Negative (0)。
最新更新，为解决IHC_Profiler安装失败的问题，我更改了IHC_Profiler的原代码，整个插件变成了newIHC_Profiler.ijm，可以在GitHub上下载到：
newIHC_Profiler.ijmgithub.com/ethanzhao9/ImageJ-Tutorial/blob/master/newIHC_Profiler.ijm
插件使用方法：
1、通过Image -> Color -> Color Deconvolution，分离出想要测量的Channel：
2、选中想要测量的Channel，Run这个Macro，即可得到4种评分所占面积的百分比：
注意IHC_Profiler里四个评分的定义：
- High positive (灰度值0-60)
- Positive (灰度值61-120)
- Low Positive (灰度值121-180)
- Negative (灰度值181-236)
1、插件安装
注意：Fiji和IHC Profiler会出现不兼容的情况，导致结果错误，建议在ImageJ1中安装这个插件并使用。
ImageJ1的下载链接：
https://imagej.nih.gov/ij/download.html
该插件的安装包括插件和宏的安装，下载地址：
IHC Profilersourceforge.net/projects/ihcprofiler/
若无法打开可以在GitHub上下载到：
https://github.com/inanezhao/ImageJ-Tutorial/blob/master/IHC_Profiler.zip
压缩包里包含下面三个文件插件文件夹、宏文件以及官方安装教程：
（1）插件安装
将IHC Profiler文件夹放在Plugins中，重启ImageJ即可安装IHC Profiler插件：
（2）宏安装（对于Fiji是必需且重要的）
Fiji安装宏的步骤和网传的版本不同，因为IHC Profiler是基于ImageJ最初的版本编写的，在FIji上使用的时候会有不兼容的情况。
首先将IHC_Profiler.txt文件放到macros文件夹中。
然后点击Plugins -> Macros -> Install，选择该txt文件（如果是ImageJ1则跳过这一步）：
即可在Plugins -> Macros中找到该宏：
注意！！！每次关闭ImageJ后，再次使用IHC Profiler需要重新安装该宏。否则得出的结果是错误的。
2、插件使用
该插件的基本原理为先对染色图片进行颜色去卷积，分出蓝色的阴性区域和棕色的阳性区域，然后判断染色类型是细胞质染色还是细胞核染色，再分别进行对应的操作[2]。
插件工作流程
（1）以细胞质染色为例：
打开图片和插件（Plugins -> IHC_Profiler）
打开插件后选择细胞质染色的Mode：
颜色去卷积默认H DAB染色：
然后即可分别得到阴性区域和阳性区域，直接得出结果：
（2）以细胞核染色为例：
选择细胞核染色Mode，并不会直接得出结果，需要先设定一个阈值：
然后点击上面安装的宏（Plugins -> Macros -> IHC_Profiler），即可得到结果：
二、Trainable Weka Segmentation-自动阳性细胞计数
该插件的使用请参考这篇文章：
Treasure琛：ImageJ实用技巧——基于机器学习的自动细胞分割(插件篇)220 赞同 · 91 评论文章编辑
一般的免疫组化图片不能通过Threshold的方法进行分割，需要利用该插件，基于机器学习算法，做到阳性细胞和阴性细胞的计数。
例如统计上图中，阳性细胞和阴性细胞的数量，经过训练之后分类器可以很好的分出阳性细胞、阴性细胞以及背景（甚至可以区分出强阳性和弱阳性细胞）：
点击Create result、Get Probability可以得到分割后的图像：
通过Analyze Particles可以快速得到细胞的数量，可以参考这篇文章：
Treasure琛：ImageJ实用技巧——自动细胞计数(解放双手篇)724 赞同 · 160 评论文章编辑
三、总结
该篇文章完整讲述了怎么利用IHC Profiler进行免疫组化分析，补充了利用Trainable Weka Segmentation对阳性细胞进行自动统计。
以后对于免疫组化分析，不必再过度依赖人工，可以通过软件的自动分析得到更加直观和稳定的数据。但前提是样品的制备、染色以及拍照时要注意避免假阳性。
与此同时，在使用插件的时候要多思考，多研究，避免出现分析错误的情况。（例如，若不安装IHC Profiler的宏文件，得出的结果会完全相反）。
推荐阅读介绍IHC Profiler的这篇文献[2]，以更深入地了解自动免疫组化分析的原理。
四、补充
（1）插件报错问题
如果插件出现报错等不能用的情况，建议换用ImageJ1来安装这个插件，在ImageJ1中使用，而不是Fiji。
（2）共染问题
免疫组化共染不能用IHC Profiler来进行分析，这个插件现在只包含了DAB。
如果想要分析共染的荧光强度的话，比较好的方法是通过Colour Deconvolution（Image -> Color -> Colour Deconvolution）
选择H&E DAB把粉红色、棕色以及蓝色，三个通道分别分离出来（但要注意免疫组化本身并不是化学计量的）。
通道分割结果
可以参考下面这个网站：
Colour-deconvolutionblog.bham.ac.uk/intellimic/g-landini-software/colour-deconvolution/
参考文献：
[1].Jensen, Ellen C . Quantitative Analysis of Histological Staining and Fluorescence Using ImageJ[J]. The Anatomical Record, 2013, 296(3):378-381.
[2].Varghese F, Bukhari A B, Malhotra R, et al. IHC Profiler: An Open Source Plugin for the Quantitative Evaluation and Automated Scoring of Immunohistochemistry Images of Human Tissue Samples[J]. Plos One, 2014, 9(5):e96801.
